mRNA疫苗技术因其快速开发和高效诱导免疫反应的能力，在COVID-19大流行期间得到了广泛应用。LNPs作为mRNA疫苗的主要递送载体，不仅保护mRNA免受降解，还能作为佐剂增强免疫反应。然而，LNPs的佐剂活性受其组成成分的影响，尤其是PEG脂质和磷脂的种类和比例。近期，宾夕法尼亚大学Norbert Pardi课题组在nature nanotechnology上发表题为“Tailoring the adjuvanticity of lipid nanoparticles by PEG lipid ratio and phospholipid modifications”的研究。该研究旨在通过系统调节LNPs中PEG脂质的比例和磷脂的类型，探究其对LNPs佐剂性的影响。

Fig. 1 | Design and characterization of S-2P mRNA–LNP variants.

01
实验结果

研究通过肌肉注射四种不同（图1）组成的S-2P mRNA-LNPs（LNP Q（含DSPC磷脂和1.5% PEG脂质）、LNP H（含DSPC磷脂和0.5% PEG脂质）、LNP Y（含DOPG磷脂和0.5% PEG脂质）、LNP W（含DOPS磷脂和1.5% PEG脂质））到BALB/c小鼠体内，评估了它们对体液免疫反应的影响。结果显示，所有LNP制剂均能诱导高水平的SARS-CoV-2刺突蛋白受体结合域（RBD）特异性IgG抗体，并表现出强大的中和活性（图2b, c）。然而，在抗体水平和中和活性方面存在显著差异。特别是在免疫后4周和16周，LNP H组的抗体水平和中和活性显著高于其他组。具体而言，LNP H组的抗体水平在16周时比LNP Q、LNP Y和LNP W组高出三倍以上，中和活性则比LNP W组高出四倍。进一步分析抗体亚型和记忆B细胞（MBCs）及长寿浆细胞（LLPCs）的数量，发现LNP H组不仅诱导了最高水平的IgG1、IgG2a和IgG2b抗体分泌细胞，还产生了最大数量的MBCs和LLPCs（图2d-f）。这表明LNP H在诱导长期体液免疫记忆方面具有显著优势。

Fig. 2 | LNP formulations with different phospholipids and PEG lipid ratios induce distinct humoral, LLPC and MBC immune responses.

为了评估LNP制剂对细胞免疫反应的影响，研究检测了小鼠脾脏中SARS-CoV-2刺突蛋白特异性CD8+ T细胞的反应。结果显示，所有LNP制剂均能诱导抗原特异性CD8+和CD4+ T细胞产生1型辅助性T细胞（Th1）免疫反应细胞因子，包括干扰素γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）（图3b-d）。然而，在CD8+ T细胞反应方面，LNP W组显著高于其他组。特别是，LNP W诱导了更高频率的IFN-γ和TNF-α双阳性抗原特异性CD8+ T细胞。

Fig. 3 | Phospholipids and PEG lipids have an impact on antigen-specific CD8+ T cell responses.

为了探究不同LNP制剂在体内的分布模式，研究使用体内成像系统（IVIS）监测了Luc mRNA-LNPs在小鼠体内的生物发光信号。结果显示，尽管所有LNP制剂均能产生强烈的生物发光信号，但它们的分布模式存在显著差异（图4a）。具体而言，含有两性离子磷脂（DSPC）的LNP Q和LNP H在全身生物发光信号上显著高于含有阴离子磷脂（DOPG和DOPS）的LNP Y和LNP W（图4b, c）。然而，在注射部位肌肉，LNP H组的蛋白质产量显著高于其他组（图4b, c）。

Fig. 4 | Phospholipid and PEG lipid ratio influence the biodistribution of LNPs

为了更详细地了解LNP在体内的分布情况，研究进一步分析了注射后4小时和3天小鼠肝脏、脾脏和引流淋巴结（dLNs）中的Luc活性、mRNA水平和脂质含量。结果显示，在注射后4小时（图4d），LNP H在dLNs中的Luc表达显著高于其他组。相比之下，LNP Q在肝脏中的表达水平最高，其次是LNP H（图4d）。而含有阴离子磷脂的LNP Y和LNP W在肝脏中的表达水平较低。

为了探究不同LNP组成对细胞摄取的影响，研究使用DC2.4细胞系和人单核细胞来源的树突状细胞（HuMDDCs）进行了体外摄取实验。结果显示，含有DSPC的LNP Q和LNP H在DC2.4细胞和HuMDDCs中的摄取效率显著高于含有阴离子磷脂的LNP Y和LNP W（图5a-d）。特别是在DC2.4细胞中，LNP H的摄取效率显著高于所有其他制剂（图5a, b）。在HuMDDCs中，LNP H的摄取效率也显著高于LNP Y和LNP W（图5c, d）。

进一步分析显示，LNP H在DC2.4细胞中的内体逃逸能力也显著高于LNP W（图5e, f）。这表明LNP H不仅具有更高的细胞摄取效率，还能更有效地将mRNA释放到细胞质中，从而可能增强其佐剂活性。

Fig. 5 | In vitro mRNA–LNP cellular uptake and mRNA endosomal escape.

为了评估LNP制剂在体内的炎症反应，研究分析了注射后4小时和24小时dLNs中的免疫刺激细胞因子谱。结果显示，所有LNP制剂均能促进强烈的细胞因子/趋化因子反应，但在4小时时间点，LNP H诱导了最高水平的IL-6细胞因子，而LNP W诱导了最高水平的IL-1β细胞因子。在注射部位肌肉，我们还评估了接种后1天、3天和5天的先天免疫细胞浸润情况。结果显示，中性粒细胞在第一天达到峰值，而巨噬细胞和单核细胞在第五天达到最高水平。对于所有制剂，第一天LNP H组的树突状细胞（DCs）水平较高，但各组之间无统计学显著差异。

02
讨论

研究通过调节LNPs中PEG脂质的比例和磷脂的类型，成功定制了具有不同佐剂活性的LNPs。LNP H通过优化PEG脂质比例和磷脂种类，显著增强了抗体反应，而LNP W则通过类似的优化策略，显著增强了CD8+ T细胞反应。这些发现为开发针对不同疾病类型的定制化疫苗提供了重要依据。