前列腺癌是全球男性健康的重要威胁，尤其是CRPC阶段，其治疗极具挑战性。传统治疗方法如雄激素剥夺疗法（ADT）虽能延缓疾病进展，但最终会因产生耐药性而失效。因此，开发新的治疗手段，特别是针对CRPC的靶向疗法，显得尤为重要。RNA疗法，尤其是mRNA疗法，因其能够特异性地调控基因表达，近年来在癌症治疗中展现出巨大潜力。然而，mRNA的体内递送面临诸多挑战，包括稳定性差、免疫原性高以及靶向性不足等。脂质纳米颗粒（LNPs）作为一种高效的核酸递送系统，因其良好的生物相容性和可调控的物理化学性质，被广泛应用于mRNA疫苗和基因治疗领域。然而，传统LNPs在体内的非特异性分布限制了其在肿瘤治疗中的应用效果。PSMA作为一种在CRPC细胞中高度表达的膜蛋白，为开发靶向递送系统提供了理想的靶点。纳米抗体（VHHs），因其分子量小、免疫原性低、稳定性高，成为理想的靶向配体。近日，Raymond M. Schiffelers等人在 Advanced healthcare materials发表题为“Nanobody-Decorated Lipid Nanoparticles for Enhanced mRNA Delivery to Tumors In Vivo”的研究。本研究旨在通过点击化学将抗前列腺特异性膜抗原（PSMA）纳米抗体修饰到LNPs表面，构建一种能够特异性靶向PSMA阳性前列腺癌细胞的mRNA递送系统。

示意图

01
实验结果

抗PSMA LNPs的制备与表征：通过凝胶电泳分析点击化学反应及纳米抗体（VHH）与DSPE-PEG(2000)-DBCO连接产物，确认了最佳Sortase A浓度为1μM，VHH与DSPE-PEG(2000)的最佳比例为1:3。在此条件下，VHH与DSPE-PEG(2000)的共轭效率最高，且副产物最少。利用抗Myc抗体通过Dot Blotting检测最终靶向LNPs溶液中的VHH，结果显示，LNPs表面成功修饰了VHH，且滤过液中未检测到VHH泄漏，表明VHH与LNPs的结合稳定。通过dSTORM超分辨显微镜成像及聚类分析，确认约80%的抗PSMA LNPs表面至少含有一个VHH分子。这一结果证明了纳米抗体成功修饰到LNPs表面，为后续的靶向递送实验奠定了基础。

Figure 2. Through dSTORM imaging and cluster analysis we identified VHH on the surface of anti-PSMA LNPs.

体外细胞实验：在体外实验中，抗PSMA LNPs在PSMA阳性细胞（B16-F10-PSMA和LNCaP）中的摄取和mRNA转染效率显著高于PSMA阴性细胞（B16-F10和DU145）及对照LNPs（R2-LNPs）。具体数据显示，抗PSMA LNPs在B16-F10-PSMA细胞中的摄取量是对照组的14倍，mRNA转染效率是对照组的18倍。在LNCaP细胞中，抗PSMA LNPs的摄取和转染效率也显著高于对照组。通过预处理不同浓度的游离抗PSMA VHH，验证抗PSMA LNPs的摄取是否依赖于PSMA受体。结果显示，随着游离VHH浓度的增加，抗PSMA LNPs在B16-F10-PSMA细胞中的摄取和转染效率显著降低，表明抗PSMA LNPs的摄取是PSMA受体介导的。

Figure 3. LNP uptake and mRNA transfection of anti-PSMA LNPs in PSMA+ cells are receptor-mediated.

斑马鱼胚胎移植瘤模型：在斑马鱼胚胎移植瘤模型中，抗PSMA LNPs在LNCaP移植瘤中的积累和BFP mRNA转染效率显著高于对照LNPs（R2-LNPs）。具体数据显示，抗PSMA LNPs处理组的肿瘤区域BFP荧光信号强度显著高于对照LNPs组。这一结果表明，抗PSMA LNPs能够在活体动物模型中特异性靶向递送mRNA至PSMA阳性肿瘤细胞。

Figure 4. Anti-PSMA LNPs show targeted mRNA delivery to metastatic PCa cells in a Zebrafish Xenograft model.

小鼠移植瘤模型：在小鼠B16-F10-PSMA移植瘤模型中，系统性给予抗PSMA LNPs和对照LNPs后，24小时的组织分布分析显示，抗PSMA LNPs在肿瘤组织中的积累量显著高于对照LNPs（3.24% ID/g vs. 1.24% ID/g）。然而，在肿瘤组织的luciferase mRNA表达水平上，抗PSMA LNPs与对照LNPs之间无显著差异。通过对肿瘤组织进行冷冻切片和免疫荧光染色，发现抗PSMA LNPs处理组的肿瘤组织中Cy5信号强度和Cy5阳性区域面积显著高于对照LNPs组。单细胞悬浮液分析显示，LNPs主要积累在免疫细胞和内皮细胞中，而非肿瘤细胞。这可能解释了为何肿瘤组织的luciferase mRNA表达水平未显著提高。进一步分析发现，抗PSMA LNPs处理组的肿瘤组织坏死比例有增加趋势。通过Zombie Aqua和Trypan Blue染色以及H&E染色评估肿瘤细胞活力，发现肿瘤组织的坏死状态可能影响了mRNA的表达效率。这表明，肿瘤微环境中的坏死细胞虽能摄取LNPs，但无法有效表达mRNA，从而限制了抗PSMA LNPs的疗效。

Figure 5. Anti-PSMA LNPs show enhanced tumor accumulation but not functional mRNA transfection in mouse tumors after 24 h

02
讨论

本研究成功开发了一种基于纳米抗体修饰的LNPs系统，用于特异性靶向递送mRNA至PSMA阳性前列腺癌细胞。体外实验结果表明，该系统显著提高了mRNA在PSMA阳性细胞中的摄取和转染效率。然而，体内实验结果显示，尽管抗PSMA LNPs在肿瘤部位的积累趋势与体外实验一致，但肿瘤部位的mRNA表达水平并未显著提高。这可能与肿瘤组织的坏死状态有关，坏死细胞虽能摄取LNPs，但无法有效表达mRNA。