mRNA疗法在疫苗开发、蛋白质替代治疗及基因编辑等领域展现出巨大潜力，但其临床应用仍面临两大挑战：一是mRNA分子难以穿透细胞膜且易被核酸酶降解；二是现有递送系统普遍存在内体逃逸效率低（仅约2%）与免疫原性调控困难的问题。脂质纳米颗粒（LNPs）作为主流递送平台，其核心组分可电离脂质的结构优化对提升递送效能至关重要。然而，传统研究多聚焦于可电离脂质的胺头基和连接区，对疏水尾部不饱和度的作用机制缺乏系统探讨。中山大学刘志佳团队在Journal of Controlled Release发表名为“Impact of tail unsaturation in ionizable lipids on mRNA delivery efficiency and immunogenicity of lipid nanoparticles”的研究。该研究通过构建可电离脂质库，系统揭示尾部不饱和度如何通过调控理化性质、内体逃逸效率影响mRNA递送效能，并探索其免疫调控机制。

示意图

Fig. 1. Design and synthesis of a small library of ionizable lipids with identical backbones and only varying degrees, types, and position of unsaturation in hydrophobic tails.

01
实验结果

本研究成功合成了17种具有不同尾部不饱和度的可电离脂质，通过四组分Ugi反应（Ugi-4CR）系统实现了对脂质尾部双键数量、类型和位置的精确调控。动态光散射（DLS）结果显示，LNPs的粒径受尾部不饱和度显著影响：当双键总数（Ω）为0时（如C0-I0），LNP粒径约为60 nm，显著小于MC3基LNP（约85 nm）；随着Ω增加至1-3，粒径与MC3基LNP相近（80-100 nm）；当Ω达到4时（如C3-I1和C2-I2），粒径增大至120-130 nm（图2B）。所有LNPs的PDI均低于0.3，表明粒径分布均匀（图2C）。Zeta电位测量显示，LNPs表面带弱负电荷（图2D）。mRNA包封效率分析表明，Ω=0和1的LNPs包封率较低（60-70%），而Ω≥2的LNPs包封率显著提高至85-95%（图2E）。此外，所有LNPs在4°C储存条件下均表现出高胶体稳定性，仅C0-I0在储存后粒径略有增加。在模拟生理条件（10% FBS, 37°C）下，所有LNPs在24小时内粒径均有所增加，但未出现显著聚集。

Fig. 2. Preparation and characterization of LNPs.

在HepG2细胞中的体外转染实验显示，所有LNPs均表现出良好的生物相容性，相对细胞活力超过80%（图3A）。在无血清条件下，除C0-I0、C1-I1、C2'-I1和C3-I1外，多数LNPs的转染效率与MC3基LNP相当；而在含血清条件下，几乎所有LNPs的转染效率均显著提高，尤其是Ω≥2的LNPs表现出优于MC3的性能（图3B）。进一步分析表明，转染效率与尾部不饱和度之间存在相关性，其中羧酸端疏水尾部（R3）的双键数量对转染效率的影响更为显著。

内体逃逸能力通过溶血实验和Gal8-YFP招募实验进行评估。溶血实验显示，在pH 5.5条件下（模拟内体环境），所有LNPs的溶血率均显著高于pH 7.4条件（生理pH），且溶血率与Ω值在pH 5.5时呈正相关（PCC=0.7459, p=0.0006）（图3F）。特别是C2'-I1、C1-I2、C3-I1和C2-I2等LNPs的溶血率与MC3基LNP相当，表明其具有较强的内体膜破坏能力（图3D）。Gal8-YFP招募实验直观展示了LNPs的内体逃逸过程，共聚焦显微镜观察发现，经LNPs处理3小时后，Gal8-YFP-HeLa细胞内出现明显的黄色荧光斑点，表明内体膜被破坏（图3H）。

Fig. 3. In vitro mRNA transfection and endosomal escape of LNPs.

BALB/c小鼠静脉注射Fluc-mRNA负载的LNPs后，生物发光成像显示，所有LNPs均主要靶向肝脏，蛋白表达分布占比86%-97%（图4A, B）。进一步分析表明，尾部不饱和度对肝脏靶向递送效率有显著影响：当Ω=0或1时，多数LNPs的递送效率低于MC3基LNP，但C0-I1例外；当Ω增加至2-4时，7种LNPs（C2-I0、C2'-I0、C1-I1、C1''-I1、C0-I2、C3-I0和C3-I1）的递送效率显著提高，其中C2-I0、C0-I2和C3-I1优于MC3（图4C）。值得注意的是，当Ω=2时，含顺式双键的C1-I1递送效率高于含反式双键的C1'-I1；当Ω>2时，羧酸端疏水尾部（R3）双键数量较多的LNPs（如C3-I0和C3-I1）递送效率更高（图8E）。相关性分析显示，递送效率与R3尾部不饱和度（Ω'）呈显著正相关（PCC=0.5770, p=0.0307），但与总Ω值、粒径和Zeta电位无显著相关性（图4D-F）。此外，mRNA包封效率与体内递送效率呈正相关（PCC=0.5037, p=0.0393）（图4G）。

Fig. 4. In vivo expression and biodistribution after i.v. administration of LNPs encapsulating Fluc-mRNA (0.125 mg/kg per mouse, n = 3).

肌肉注射后，蛋白表达主要分布在肝脏和注射部位肌肉。与静脉注射类似，尾部不饱和度影响体内递送效率，但无显著相关性（图5C, E）。C2-I0在肝脏和肌肉中的递送效率均优于MC3基LNP（图5C, D）。进一步分析表明，粒径在80-90 nm范围内的LNPs肝脏靶向性更优（图5F），且mRNA包封效率较高的LNPs通常表现出更高的递送效率（图5G）。

Fig. 5. In vivo expression and biodistribution after i.m. administration of LNPs encapsulating Fluc-mRNA (0.125 mg/kg per mouse, n = 3).

静脉注射Fluc-mRNA负载的LNPs后，血清细胞因子检测显示，不同LNPs诱导的免疫反应存在差异。C0-I1、C2-I0、C2'-I0、C1-I1和C0-I2在6-48小时内诱导的IFN-γ水平低于MC3基LNP，而C1''-I1、C3-I0和C3-I1在24-48小时内诱导的IFN-γ水平较高（图6B）。IL-6水平在6小时时普遍升高，但C0-I1和C2'-I0除外，且所有LNPs在48小时内均恢复至正常水平（图6C）。IL-10水平在24-48小时内由C1''-I1和C3-I0显著诱导（图6F）。TNF-α和IL-1β水平在各LNPs间无显著差异（图6D, E）。RAW 264.7细胞实验进一步证实，不同LNPs诱导的IL-6分泌水平与其尾部不饱和度相关，其中C0-I1和C2'-I0的IL-6分泌量显著低于MC3基LNP。

小鼠体温、体重及血清生化指标监测显示，所有LNPs均表现出良好的安全性。注射后1小时，所有LNPs组小鼠的肛温变化均小于MC3基LNP（图6H）。血清生化指标（AST、ALT、CREA、UREA）与未处理组（PBS）无显著差异（图6I-L），且7天内小鼠体重无显著变化。

Fig. 6. Serum cytokines and markers analysis in mice after i.v. injection with Fluc-mRNA encapsulated LNPs.

以IL-27 mRNA为模型，评估C2-I0和C2'-I0在蛋白质补充治疗中的潜力。静脉注射0.25 mg/kg IL-27 mRNA负载的LNPs后，血清IL-27水平在6小时达到峰值，随后逐渐下降（图7B）。AUC分析显示，C2-I0和C2'-I0基LNPs的IL-27表达量分别为MC3基LNP的1.76倍和1.38倍（图7C）。安全性评估显示，两种LNPs均未引起肝肾功能损伤（图7D-I）。值得注意的是，顺式（C2-I0）和反式（C2'-I0）双键对IL-27蛋白表达无显著影响（图7B, C）。

Fig. 7. LNP-mediated hepatic delivery of IL-27 mRNA.

02
结论

本研究系统揭示了可电离脂质尾部不饱和度对mRNA LNP递送效率和免疫原性的调控机制。通过优化双键数量和位置，可显著提升mRNA包封率、内体逃逸效率和肝靶向性，同时降低免疫原性。C2-I0和C2'-I0脂质在蛋白质替代治疗中展现出高效、安全的潜力，为精准设计mRNA递送载体提供了重要理论依据。未来研究可进一步探索更高不饱和度脂质的性能，并拓展至其他给药途径（如吸入或局部给药）的应用。