信使核糖核酸（mRNA）疗法作为疾病治疗的新兴手段，通过引入修饰的核苷酸（如假尿嘧啶）显著降低了mRNA的免疫原性并提高了其稳定性。然而，现有的脂质纳米颗粒（LNPs）作为mRNA递送载体，其内在的高免疫原性限制了mRNA疗法的广泛应用。因此，开发低免疫原性的离子化脂质对于提高mRNA疗法的疗效和安全性至关重要。近日，中科大宫宁强教授与宾大Michael J. Mitchell 团队合作研究“Mannich reaction-based combinatorial libraries identify antioxidant ionizable lipids for mRNA delivery with reduced immunogenicity”，并发表于nature biomedical engineering。该研究成功构建了包含584种离子化脂质的曼尼希反应文库，并发现C-a16脂质在多种细胞系中均展现出优异的转染性能，在基因编辑、肿瘤疫苗、传染病疫苗方面均好于市售的MC3脂质。

01
实验结果

C-a16 LNPs在基因编辑中的应用：静脉注射封装Cas9 mRNA和Ttr sgRNA的C-a16 LNPs后，小鼠血清中Ttr蛋白水平降低了约55%，Ttr基因编辑效率达到约50%，显著高于DLin-MC3-DMA LNPs组（图1f, g）。

Fig.1. LNP-mediated co-delivery of Cas9 mRNA and Ttr sgRNA for transthyretin (Ttr) gene editing. Mice received intravenous injections of LNPs codelivering Cas9 mRNA and Ttr sgRNA (4:1, wt/wt) at a total RNA dose of 2 mg kg-1.

C-a16 LNPs肿瘤新生抗原疫苗：C-a16 LNPs递送编码OVA mRNA后，诱导了更高比例的SIINFEKL-Tetramer+ T细胞（1.42%），显著高于SM-102 LNPs和C-a16-Q LNPs组。在B16F10-OVA肿瘤模型中，C-a16 LNPs显著抑制了肿瘤生长，肿瘤体积显著小于PBS、SM-102 LNPs和C-a16-Q LNPs组（图2b）。在B16F10肿瘤模型中，C-a16 LNPs递送编码Pbk-Actn4 mRNA也显著抑制了肿瘤生长（图2c）。

Fig.2. | Inhibition of tumour growth by C-a16 LNP encapsulating an OVA mRNA or a neoantigen mRNA. a, Mice were subcutaneously injected with either B16F10 cells expressing OVA or B16F10 cells on day 0. LNPs encapsulating mRNA encoding OVA or the neoantigen Pbk-Actn4 were administered intramuscularly on days 7 and 14 (0.25 mg kg-1).

C-a16 LNPs SARS-CoV-2疫苗：C-a16 LNPs递送编码SARS-CoV-2刺突蛋白mRNA后，诱导了更强的RBD特异性CD4+和CD8+ T细胞应答，产生了更高水平的IFN-γ、IL-2和TNF-α（图3b-g）。

抗体应答：C-a16 LNPs诱导了更高滴度的RBD特异性IgG抗体（4.1 × 10^6），显著高于SM-102 LNPs和C-a16-Q LNPs组（图3h-j）。此外，C-a16 LNPs还诱导了更高水平的中和抗体（图3k）。C-a16 LNPs显著增加了RBD特异性记忆B细胞和长寿命浆细胞的数量。

Fig.3. Immune responses elicited by C-a16 LNP encapsulating mRNA encoding SARS-CoV-2 spike protein.

C-a16主要通过减轻细胞内活性氧（ROS）的生成，并减少氧化应激对细胞的损伤，来提高mRNA的转染效率。具体来说：

1-ROS水平降低：C-a16 LNPs处理的MC38细胞内ROS水平显著低于DLin-MC3-DMA LNPs处理的细胞。这表明C-a16具有直接或间接清除ROS的能力，从而维持细胞内氧化还原平衡。

2-氧化应激相关基因表达下调：RNA测序分析显示，C-a16 LNPs处理减少了氧化应激相关基因（如Hmox1、Gclm、Slc7a11等）的表达。这些基因通常在细胞受到氧化损伤时上调，以应对氧化应激。C-a16通过下调这些基因的表达，进一步证明了其抗氧化特性。

3-免疫激活基因表达减少：除了氧化应激相关基因外，C-a16 LNPs处理还减少了免疫激活基因（如细胞死亡和先天免疫激活相关基因）的表达。这表明C-a16不仅具有抗氧化作用，还能降低免疫原性，减少炎症反应。

4-细胞毒性降低：与DLin-MC3-DMA LNPs相比，C-a16 LNPs在体外实验中表现出相似的转染效率，但细胞毒性显著降低。这可能与C-a16的抗氧化特性有关，因为氧化应激是导致细胞死亡的重要因素之一。

5-体内实验验证：在小鼠体内实验中，C-a16 LNPs递送mRNA后，显著降低了血清中炎症细胞因子（如IL-6）的水平，进一步证明了其抗氧化和低免疫原性特性。

Fig.4. Mechanism study of mRNA transfection by C-a16 LNPs.

02
讨论

本研究利用曼尼希反应成功构建了多样化的离子化脂质文库，并通过高通量筛选发现了具有抗氧化和低免疫原性特性的C-a16脂质。C-a16 LNPs在体内外均展现出高效的mRNA递送能力和持久的蛋白表达，为基因编辑、蛋白替代疗法及疫苗开发提供了新的递送平台。未来的研究将进一步探索C-a16 LNPs在不同疾病治疗中的应用潜力。