Fanconi贫血（FA）是一种遗传性血液疾病，由22个已知基因的突变引起，这些基因编码的FA蛋白在DNA交联修复中起关键作用。FA患者常表现为造血干细胞（HSCs）迅速耗竭和骨髓衰竭。目前，唯一的治愈方法是同种异体骨髓移植，但存在供体匹配困难和移植相关风险等问题。因此，基因修复或添加疗法成为有吸引力的替代方案。
现有基因疗法主要集中于体外修饰HSCs后回输患者体内，但这种方法存在HSCs动员困难、体外传代过程中存活率低以及对传统预处理策略敏感等问题。本研究提出了一种新的体内蛋白替代疗法，即通过LNPs递送mRNA至体内，实现FA蛋白的体内表达，从而恢复HSPC功能。
01
材料与方法
1.1 材料：
- 实验动物：Fancc缺陷小鼠（Fancc-/-）及野生型（WT）小鼠，购自Jackson Laboratory。
- LNPs：由Acuitas Therapeutics提供，包含可离子化阳离子脂质、磷脂酰胆碱、胆固醇和聚乙二醇（PEG）脂质。
- mRNA：线性或环状Fancc mRNA，通过体外转录合成，并进行5'帽结构和3'多聚腺苷酸尾修饰。
1.2 方法：
- LNP制备与表征：将mRNA与LNPs按一定比例混合，通过旋转蒸发法制备LNP-mRNA复合物，并测定其粒径、zeta电位和RNA包封率。
- 动物实验：通过静脉注射（IV）或股骨内注射（IF）将LNP-mRNA复合物递送至小鼠体内。在不同时间点收集骨髓、脾脏和肝脏等组织，评估mRNA的转染效率和表达水平。
- 功能验证：通过集落形成实验评估LNP-mRNA处理对Fancc缺陷HSPCs增殖能力和烷基化剂抵抗性的影响。同时，通过流式细胞术分析HSPCs的免疫表型变化。
02
实验结果
2.1 增殖能力恢复：
通过集落形成实验评估了LNP-Fancc处理对Fancc缺陷HSPCs增殖能力的影响。结果显示，LNP-Fancc处理显著增加了Fancc缺陷HSPCs形成的集落数量（图1A-C, D-F）。这表明LNP-Fancc处理能够有效恢复Fancc缺陷HSPCs的增殖能力。
2.2 烷基化剂抵抗性恢复：
Fancc蛋白在DNA交联修复中起关键作用，因此Fancc缺陷细胞对烷基化剂（如丝裂霉素C，MMC）高度敏感。本研究通过评估LNP-Fancc处理对Fancc缺陷HSPCs烷基化剂抵抗性的影响，进一步验证了LNP-Fancc的功能恢复效果。
结果显示，LNP-Fancc处理显著提高了Fancc缺陷HSPCs对MMC的抵抗性（图1B-C, E-F）。这表明LNP-Fancc处理能够有效恢复Fancc缺陷HSPCs的DNA修复能力，从而增强其对烷基化剂的抵抗性。
Figure 1. In vitro delivery of FANCC LNPs to correct FA-deficient BM-derived HSPCs
2.3 递送效率比较：
本研究通过静脉注射（IV）和股骨内注射（IF）两种途径将LNP-mRNA复合物递送至Fancc缺陷小鼠（Fancc-/-）体内。结果显示，无论采用哪种注射方式，LNP-mRNA均能有效转染至小鼠骨髓（BM）细胞。相比IV注射，IF注射在骨髓中的转染效率更高。具体来说，IF注射后，注射侧股骨中LNP标记的细胞比例显著高于未注射侧股骨及脾脏等系统性分布组织（图2D-F）。这一结果表明，直接注射至骨髓腔能够更有效地将LNP-mRNA递送至目标细胞。
Figure 2. IF delivery of Cre-recombinase LNP to stably induce reporter expression
2.4 mRNA表达水平评估：
使用荧光报告基因mCherry和荧光素酶报告系统评估了mRNA在体内的表达水平。结果显示，IF注射后骨髓中mCherry的阳性细胞比例和平均荧光强度（MFI）均显著高于IV注射（图3A-D）。
Figure 3. IF vs. IV delivery of fluorescent reporter LNP
荧光素酶报告系统进一步证实了这一结果。IF注射后，注射侧股骨的荧光素酶活性显著高于未注射侧股骨及脾脏等组织（图4A-B, E-H）。这些结果表明，IF注射能够更有效地实现mRNA在骨髓中的表达。
Figure 4. In vivo LNPLFluc expression after IF or IV delivery
2.5 mRNA表达寿命分析：
为了评估mRNA在体内的表达寿命，本研究比较了线性mRNA和环状mRNA在骨髓细胞中的表达情况。结果显示，环状mRNA的表达寿命显著长于线性mRNA（图5E-F）。在体外实验中，使用荧光素酶报告系统监测了LNP-Fancc处理后的Fancc缺陷造血干祖细胞（HSPCs）中Fancc mRNA的表达寿命。结果显示，环状mRNA处理组细胞的荧光素酶活性在较长时间内保持较高水平（图5G-H），表明环状mRNA能够更有效地延长mRNA在体内的表达寿命。
Figure 5. Functional lifetime of LNP mRNAs
2.6 免疫原性分析：
通过定量实时PCR分析了LNP处理对Fancc缺陷HSPCs免疫基因表达的影响。结果显示，尽管部分免疫相关基因的表达水平有所变化，但这些变化并未达到统计学显著性（图6A-B）。这表明LNP处理未引起显著的免疫原性反应，为LNP-mRNA疗法的临床应用提供了重要的安全性依据。
Figure 6. Immune screening of HSPCs after LNP treatment
2.7 重复给药效果：
为了评估重复给药对Fancc缺陷HSPCs功能恢复的影响，本研究在体外实验中进行了多次LNP-Fancc处理。结果显示，多次LNP-Fancc处理能够进一步提高Fancc缺陷HSPCs的增殖能力和烷基化剂抵抗性（图7A-C）。
Figure 7. Impact of LNPCFancc on Fancc–/– HSPC in vitro proliferation and engraftment potential
综上所述，本研究通过LNPs递送mRNA至Fancc缺陷小鼠体内，成功实现了Fancc蛋白的体内表达，并显著恢复了Fancc缺陷HSPCs的增殖能力和烷基化剂抵抗性。同时，LNP处理未引起显著的免疫原性反应，为FA的临床治疗提供了新的策略。
03
讨论
本研究通过LNPs递送Fancc mRNA至Fancc缺陷小鼠体内，成功恢复了HSPCs的功能。这种体内蛋白替代疗法为FA的临床治疗提供了新的策略。与体外基因疗法相比，体内递送mRNA具有操作简便、无需复杂基础设施和物流支持等优势。
然而，本研究仍存在一些局限性。首先，Fancc缺陷小鼠模型并未自然呈现骨髓衰竭表型，这限制了模型对FA病理生理过程的模拟能力。其次，mRNA的表达具有瞬时性，需要重复给药以实现持久疗效。未来的研究将探索更稳定的mRNA修饰策略以及优化给药方案以提高疗效。
04
结论
本研究通过LNPs递送mRNA成功恢复了Fancc缺陷小鼠HSPCs的功能，为FA的临床治疗提供了新的策略。未来的研究将进一步优化mRNA修饰策略、给药方案以及评估该疗法的长期疗效和安全性。
参考文献：Banda, O., Adams, S. E., Omer, L., Jung, S. K., Said, H., Phoka, T., ... & Kurre, P. (2025). Restoring hematopoietic stem and progenitor cell function in Fancc mice by in situ delivery of RNA lipid nanoparticles. Molecular Therapy: Nucleic Acids, 36, 1-12.
