实验结果显示，当使用双特异性抗体（BsAbs）与mRNA负载的脂质纳米颗粒（LNPs）进行预混合时，LNPs的物理化学性质发生了显著变化。具体而言，与未修饰的LNPs（平均粒径82 nm）相比，预混合抗PSMA和抗EGFR BsAbs后的LNPs平均粒径分别增加至181 nm和412 nm（图1C）。
这一变化表明BsAbs成功结合到了LNPs表面，但同时也导致了粒径分布和形态的不均一性。动态光散射测量显示，与抗EGFR BsAbs孵育5分钟后，LNPs的粒径和PDI即出现显著增加，40分钟后粒径增至原来的三倍。
此外，冷冻透射电子显微镜观察显示，预混合后的LNPs形态发生改变，粒子间出现聚集现象（图1D）。这些结果提示，预混合策略可能影响LNPs在体内的行为，因为体内应用通常偏好粒径小于150 nm的纳米颗粒。
预混合（Pre-mixing）策略的细胞特异性递送：为了评估BsAbs介导的靶向递送效果，我们首先在表达EGFR但不表达PSMA的MDA-MB-468乳腺癌细胞和同时表达EGFR和PSMA的LNCaP前列腺癌细胞上进行了实验。
结果显示，对于MDA-MB-468细胞，仅当mRNA-LNPs与抗EGFR BsAbs预混合时，eGFP表达显著增强（图1E）。而对于PSMA阴性的MDA-MB-468细胞，与抗PSMA BsAbs预混合的mRNA-LNPs则未显示出递送效率的提升。在LNCaP细胞中，与抗PSMA BsAbs预混合的mRNA-LNPs显著提高了eGFP的表达，而与抗EGFR BsAbs预混合也表现出类似的增强效果（图1F）。这些结果证明了BsAbs介导的靶向递送具有细胞类型特异性。
Figure 1. Pre-mixing with bispecific antibodies alters physicochemical properties and delivery of mRNA-LNPs
预混合（Pre-mixing）策略和
预靶向（Pre-targeting）策略的比较
预靶向（Pre-targeting）策略的优势：进一步比较预混合与预靶向策略，我们发现预靶向策略在体外实验中表现出更高的递送效率。在MDA-MB-468细胞中，预靶向策略使eGFP表达较未靶向组提高了12倍，而预混合策略仅提高了3倍（图2A, 2B）。
类似地，在LNCaP细胞中，预靶向策略也显著提高了eGFP的表达（图2C, 2D）。这些结果支持了预靶向策略在细胞特异性递送中的优势。
Figure 2. Pre-targeting of cells with bispecific antibodies improves cell-specific delivery of mRNA-LNPs
为了评估预靶向策略在体内的效果，我们在BALB/c裸鼠皮下接种MDA-MB-468肿瘤模型上进行了实验。结果显示，与未靶向组和预混合组相比，预靶向策略显著提高了mRNA-LNP在肿瘤组织中的递送效率。具体而言，预靶向组肿瘤组织的荧光素酶表达较未靶向组提高了8倍以上，同时肝脏中的表达降低了三分之一至一半（图3B, 3C）。48小时后，预靶向组肿瘤信号保持稳定，而预混合组肿瘤信号下降了60%（图3C）。
器官分析进一步验证了体内生物分布的结果。预靶向组肿瘤组织的发光信号较未靶向组和预混合组分别提高了4.6倍和3.5倍以上（图3D）。同时，预靶向组肝脏中的总通量显著低于未靶向组和预混合组（图3E）。此外，预靶向组脾脏的摄取量也显著低于未靶向组和预混合组（图3F），表明预靶向策略减少了mRNA-LNP在非靶器官中的积累。
Figure 3. Pre-targeting with bispecific antibodies improves targeted delivery of mRNA-LNPs in vivo
预靶向策略相较于预混合系统的一个显著优势是减少了LNPs表面的蛋白质吸附。蛋白质吸附可能导致LNPs被肝脏中的受体介导的内吞作用摄取，从而降低循环时间和靶组织递送效率。
预靶向策略通过避免BsAbs与LNPs的直接结合，维持了LNPs的物理化学性质，从而减少了非特异性蛋白质吸附。
预靶向策略保持了BsAbs在体内的配体亲和力。在传统共轭抗体系统中，反应条件和抗体方向的不利变化可能导致配体亲和力下降。
而预靶向策略中，BsAbs首先与靶细胞结合，随后LNPs通过与细胞表面BsAbs的结合实现递送，从而保持了BsAbs的配体亲和力。
预靶向策略通过增加细胞表面BsAbs的结合位点，提高了mRNA-LNP的递送效率。在体外实验中，预靶向策略在EGFR表达较低的LNCaP细胞中仍表现出较高的递送效率，这可能是由于细胞表面BsAbs的结合位点多于LNPs表面PEG的结合位点，从而提高了整体亲和力。
