通过Atherton–Todd反应及衍生方法，研究构建了含44种BiPs与3种线性LiPs的化合物库（图1a-c），系统考察尾部链长（C14–C30）、分支位置、N-甲基化、极性头部及磷功能团（磷酰胺/膦酸酯/磷酸酯）对体内FLuc mRNA递送的影响；发现C20饱和支链尾部且分支点靠近磷官能团的磷酰胺脂质表现最优，其中BiP-20在CD1小鼠肝脏中产生最高生物发光信号（图1d），其LNP表观pKa为6.56（图1e），处于理想递送范围，且经DNA条形码配方优化后确认DOPE辅助脂质与常规摩尔比（50%离子化脂质/38.5%胆固醇/10% DOPE/1.5% PEG-脂质）适用于后续研究。
图 1. LiP和BiP脂质的化学合成、LNP筛选以及 CRISPR–Cas9 编辑系统的递送。
在CD1小鼠中，BiP-20 LNPs静脉注射后的荧光素酶表达较MC3 LNPs提高5.9倍，与SM102水平相当（图1f）；机制研究表明其肝脏摄取高度依赖ApoE结合（ApoE⁻/⁻小鼠信号几乎完全消失）及LDL-R介导的内吞（LDL-R⁻/⁻小鼠信号显著降低），提示该递送系统通过经典脂蛋白受体通路实现肝细胞靶向。
在TTR基因编辑中，BiP-20 LNPs共包载Cas9 mRNA与sgTTR后呈现典型球形单层结构（图1g），在2 μg低剂量下即可实现约20%编辑，10 μg时达~64%，而LP01需30 μg方可比拟（图1h），血清TTR蛋白敲低与基因组编辑数据一致（图1i）；在1 μg极低剂量下，BiP-20仍可产生约50%血清TTR降低与40% indel，显著优于MC3、SM102和LP01。在PCSK9 prime editing中（图1j），BiP-20在50 μg剂量下实现4.30%的TTAC插入率，显著优于SM102（3.33%）、MC3（1.33%）和LP01（0.1225%），证明其对复杂RNA共递送系统的高效性。
研究将floxed TMEM192-3×HA小鼠与CMV-Cre杂交获得组成性LysoTag小鼠（图2a），通过抗HA磁珠免疫沉淀从肝脏匀浆中分离纯化溶酶体，经Western blot验证Lamp1与Cathepsin C显著富集（图2c）；全肝条形码可持续检测至24小时，但溶酶体内条形码在2小时内迅速衰减（图2d,e），提示早期即发生逃逸或降解。血液动力学显示BiP-20与裸条形码均迅速清除（图2f,i），而MC3和SM102分别稳定1小时和24小时（图2g,h），DiD标记证实BiP-20在5分钟内即被肝脏快速摄取。LysoBC定量显示，BiP-20 LNPs在给药后30分钟的内体逃逸效率约为8%，1小时降至约6%（图2j），流穿液经胞质标志物验证主要代表胞质内容。
图 2. 用于脂质纳米颗粒的体内溶酶体逃逸定量检测方法的发展。
在50 μg高剂量下，BiP-20处理小鼠的血清ALT与AST水平与未处理对照相当，无肝毒性；炎症因子检测中仅SM102显著诱导IL-6升高，BiP-20、LP01和MC3无显著变化，且各组TNF水平均未改变，表明BiP-20具有优异的体内耐受性。
蛋白质组学鉴定2,395种蛋白，发现BiP-20处理组有191种差异表达蛋白（DEPs），显著多于SM102的96种（图3a,b），且直接比较中BiP-20特异性下调7种蛋白（图3c）；STRING分析显示BiP-20调控蛋白形成内体加工相关互作网络（图3d），KEGG富集于"内吞作用"通路（图3e）。BiP-20显著下调网格蛋白介导的内吞及早期内体生物发生相关蛋白，包括EEA1、Rab5、Cltc、Vps家族、Hrs（Hgs）、Snx2、Vps35、Igf2r等，提示其诱导内体成熟阻滞与回收通路失调，可能通过破坏早期内体结构或形成杂交内体促进逃逸。
图 3. 溶酶体蛋白质组学揭示了在脂质纳米颗粒（LNP）处理后，囊泡运输和代谢过程发生了改变。
通过LNP递送sgRNA实现Rab5a敲除（67.3% indel）后，LysoBC显示逃逸效率无提升甚至略降（图3h），表明干扰早期内体形成无益于逃逸；而将LysoTag小鼠与Rab7f/f小鼠杂交并经LNP-Cre实现肝脏特异性Rab7敲除（图3g）后，BiP-20与SM102的逃逸效率分别提升约4.6倍和3.7倍（图3h），蛋白质组学证实Rab7⁻/⁻小鼠溶酶体蛋白组发生大规模重塑且降解酶减少（图3i），支持"阻断晚期内体成熟可积累逃逸能力更强的成熟缺陷型杂交内体"这一模型。
