“新型冠状病毒（SARS-CoV-2）mRNA脂质纳米颗粒（LNP）疫苗的迅速获批表明，mRNA LNP疫苗在应对紧急疫苗需求方面具有多功能性。然而，mRNA疫苗无法诱导黏膜细胞反应或对近期变异株产生广泛保护。为了提高mRNA疫苗的交叉保护能力，本研究设计了一种新型mRNA LNP，其中共包载了编码细胞因子佐剂和甲型流感血凝素（HA）抗原的mRNA结构，用于皮内接种。佐剂mRNA编码一种新型融合细胞因子GIFT4，由粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和白细胞介素-4（IL-4）组成。研究发现，佐剂型mRNA LNP疫苗可诱导针对异源流感抗原的高水平体液抗体和系统性T细胞反应，并保护免疫小鼠免受甲型流感病毒感染。

此外，该疫苗还在引流淋巴结中引发早期生发中心反应，并促进抗体分泌B细胞反应。本研究还生成了另一种编码CCL27的佐剂mRNA，增强了系统性免疫反应。两种佐剂mRNA均显示出在小鼠中增强体液和细胞反应的有效佐剂作用。有趣的是，皮内接种GIFT4或CCL27 mRNA佐剂的mRNA LNP疫苗可诱导肺组织驻留T细胞。本研究表明，细胞因子mRNA可作为佐剂灵活配制到mRNA LNP疫苗中，以激发针对病毒变异的强烈免疫。”

图一、GIFT融合蛋白（GM-CSF和IL-4）示意图和mRNA/LNP示意图

01
研究结果

1.1 GIFT4 mRNA佐剂增强的HA mRNA LNP疫苗诱导增强的体液免疫应答和保护效果：

在本研究中，我们评估了不同剂量（1μg、2μg或5μg）的GIFT4 mRNA作为佐剂的效果。结果显示，与单独使用HA mRNA LNP相比，GIFT4 mRNA佐剂增强的HA mRNA LNP在单次免疫后3周，能够显著刺激小鼠血清中产生更高的Aichi特异性IgG及IgG亚型（IgG1和IgG2a）抗体水平。这些结果表明，GIFT4 mRNA作为佐剂，能够有效增强体液免疫应答。

接下来，我们评估了GIFT4 mRNA佐剂增强的LNP疫苗对同源A/Aichi病毒或异源A/Phi病毒致死性攻击的保护效果。在加强免疫后4周，免疫小鼠通过鼻腔途径分别接种5×LD50的同源A/Aichi病毒或3×LD50的异源A/Phi病毒。结果显示，接种了HA+GIFT4 mRNA LNP疫苗的小鼠体重减轻程度较轻，且存活率达到了100%，而仅接种HA mRNA LNP疫苗的小鼠体重减轻程度适中，存活率为75%。未免疫的小鼠在两种病毒感染后均表现出严重的致死性。这些结果表明，GIFT4 mRNA佐剂增强的LNP疫苗能够为小鼠提供对同源和异源流感病毒致死性剂量的有效保护。

图二、皮下注射GIFT mRNA佐剂LNP的抗体免疫反应

1.2 GIFT4 mRNA佐剂增强HA mRNA LNP疫苗改善T细胞免疫应答：

除了评估血清中的抗体应答外，对外周淋巴组织中的细胞免疫应答进行表征对于评估疫苗候选物的有效性也至关重要。我们进一步研究了抗原特异性T细胞应答。通过流式细胞术分析，我们发现GIFT4 mRNA佐剂增强的LNP疫苗能够诱导更高水平的抗原特异性CD4+和CD8+T细胞应答，这些T细胞能够分泌IFN-γ和IL-4等细胞因子，表明疫苗能够同时激发Th1和Th2型免疫应答。

图三、皮下注射GIFT mRNA佐剂LNP的细胞免疫反应

1.3 GIFT4 mRNA佐剂增强的HA mRNA LNP刺激强烈的B细胞免疫应答和早期生发中心应答：

为了评估GIFT4 mRNA佐剂增强的mRNA LNP对B细胞免疫应答的影响，我们在加强免疫后4周收集了脾脏细胞，并通过ELISpot检测抗体分泌B细胞（ASCs）。与未免疫小鼠相比，接种了GIFT4 mRNA佐剂增强的LNP疫苗的小鼠脾脏中ASCs数量显著增加。此外，我们还观察到，在免疫后7天，引流淋巴结（ILNs）中GIFT4 mRNA佐剂增强免疫的小鼠B细胞中CD95+和CD95+GL7+细胞水平升高，这表明生发中心（GC）应答被早期激活。这些结果表明，GIFT4 mRNA佐剂能够增强B细胞应答并促进早期生发中心反应。

图四、皮下注射GIFT mRNA佐剂LNP的B细胞反应和早期生发中心免疫反应

1.4 CCL27 mRNA作为佐剂同样增强体液和细胞免疫应答：

除了GIFT4 mRNA外，我们还测试了另一种细胞因子mRNA，即CCL27 mRNA作为佐剂的效果。结果显示，CCL27 mRNA同样能够增强体液和细胞免疫应答，并表现出与GIFT4 mRNA相似的佐剂活性。在异源病毒抗原刺激下，CCL27 mRNA佐剂增强的LNP疫苗能够诱导更高水平的交叉结合抗体和抗原特异性T细胞应答。

1.5 GIFT4或CCL27 mRNA佐剂增强的HA mRNA LNP皮内免疫诱导肺部T细胞免疫应答：

为了评估皮内接种mRNA LNP后肺部潜在的免疫应答，我们在加强免疫后4周牺牲了小鼠并收集了肺部样本。结果显示，与未免疫小鼠或仅接种HA mRNA LNP疫苗的小鼠相比，接种了GIFT4或CCL27 mRNA佐剂增强的LNP疫苗的小鼠肺部CD4+CD44+T细胞数量显著增加。这些结果表明，皮内接种GIFT4或CCL27 mRNA佐剂增强的LNP疫苗能够诱导肺部组织驻留T细胞应答，这对于防御呼吸道病原体至关重要。

图五、皮下注射CCL27 mRNA佐剂LNP对细胞免疫和体液免疫反应的影响

图六、皮下注射GIFT和CCL27 mRNA佐剂LNP对肺黏膜免疫反应和细胞免疫反应的作用

02
讨论

本研究设计了一种新型mRNA LNP疫苗，其中共包载了编码细胞因子佐剂和抗原的mRNA。通过皮内接种，该疫苗在小鼠中诱导了强烈的体液和细胞免疫应答，并显示出对甲型流感病毒感染的广泛保护作用。与单独接种抗原mRNA的LNP疫苗相比，佐剂型疫苗在诱导抗体产生、增强T细胞反应以及保护小鼠免受病毒感染方面均表现出显著优势。

本研究还表明，细胞因子mRNA作为佐剂具有灵活性，可根据所需的免疫效果和特定靶病原体进行适配。这种方法的可行性得到了最近关于COVID-19 mRNA疫苗中使用mRNA编码的IL-12/p70作为佐剂的研究结果的支持，进一步凸显了细胞因子mRNA佐剂在提高疫苗效力方面的潜力。

参考文献：Wei L, Zhu W, Dong C, et al. Lipid nanoparticles encapsulating both adjuvant and antigen mRNA improve influenza immune cross-protection in mice[J]. Biomaterials, 2025, 317: 123039.