“本研究介绍了一种安全有效的头颈癌（HNSCC）瘤内表皮生长因子受体（EGFR）靶向的CRISPR-脂质纳米颗粒（LNP）递送策略，用于共封装CRISPR-Cas9信使核糖核酸（mRNA）和单导向核糖核酸（sgRNA），以实现SOX2基因的敲除。我们生成了功能性靶向LNPs（tLNPs），它们共封装Cas9 mRNA与靶向SOX2的sgRNA，并涂覆有抗EGFR抗体。我们评估了它们在HNSCC癌细胞中的摄取和表达，以及体内外的治疗效果。结果显示，这些tLNPs能够特异性地靶向肿瘤细胞，诱导持久的治疗反应，为临床上高复发率的实体瘤如HNSCC提供了一种有前景的治疗方法。”

01
实验结果

1.1 sgRNA筛选与基因编辑效率：

在本研究中，我们针对SOX2基因设计了三种sgRNA（sgSOX2-A、-B、-C），并在具有不同头颈癌原发起源的HNSCC细胞系（UMSCC-104和FADU）中进行了筛选。通过转染Cas9蛋白和针对SOX2的sgRNA（形成核糖核蛋白/RNP复合物）后，比较基因编辑效率。

Sanger测序和ICE分析结果显示，sgSOX2-A在UMSCC-104细胞系中实现了58%的体外基因编辑，在FADU细胞系中实现了40%的基因编辑。因此，sgSOX2-A被选为进一步体内和体外实验的最佳导向RNA。

图一、sgRNA的体外筛选和细胞活性检测

1.2 基因编辑对细胞活性的影响：

为了评估基因编辑对细胞活性的影响，我们对转染了sgSOX2-RNP的UMSCC104和Fadu HN-SCC细胞进行了XTT增殖实验。同时，使用Turbo-GFP和YAP1 sgRNA作为对照。YAP1是一个诱导癌症干细胞特性的转录因子，在HNSCC中过表达，与SOX2类似，因此被用作高效和高表达编辑的对照。实验结果表明，SOX2基因编辑显著降低了HNSCC细胞的活性。

图二、基因编辑对细胞活性的影响和编辑效率评估

1.3 靶向LNP的表征与基因编辑效率：

我们成功制备了靶向LNPs（tLNPs），并通过透射电子显微镜进行了表征。结果显示，tLNPs具有适当的直径、多分散性指数（PDI）和ζ电位，表明其具有良好的稳定性和分散性。为了确认tLNPs的基因编辑效率，我们进行了基因编辑分析。结果显示，单次治疗tLNPs后，SOX2位点实现了约17%的基因编辑。

图三、靶向LNP的理化性质评价和编辑效率评价

1.4 生物分布与安全性评估：

在体内实验中，我们评估了tLNPs的生物分布。结果显示，tLNPs能够特异性地靶向HNSCC肿瘤，并实现高效的SOX2基因敲除。同时，我们分析了脾脏和肝脏细胞的基因编辑百分比，以确认是否存在脱靶编辑。结果显示，未发现脱靶编辑。此外，我们还评估了tLNPs的免疫原性和毒性。结果显示，SOX2-cLNPs无毒性或免疫原性。

图四、靶向LNP的体内摄取、分布和表达

1.5 靶向tLNPs在HNSCC小鼠模型中的治疗效果：

为了探索靶向tLNPs在体内介导治疗性基因编辑的能力，我们评估了其抑制HNSCC肿瘤生长的效果。我们使用异种移植HNSCC小鼠模型，通过瘤内注射靶向tLNPs。结果显示，与未治疗组相比，靶向tLNPs组实现了90%的肿瘤生长抑制和90%的生存率提高（>84天），且50%的小鼠肿瘤完全消失。这一结果表明，靶向tLNPs能够高效、特异性地靶向HNSCC肿瘤，并实现持久的治疗反应。

图五、靶向LNP的体内药效评价

02
讨论

本研究成功开发了针对头颈癌的EGFR靶向CRISPR-LNP递送策略，实现了SOX2基因的敲除，并评估了其治疗效果。结果显示，这些tLNPs能够特异性地靶向肿瘤细胞，诱导持久的治疗反应。这一策略为临床上高复发率的实体瘤如HNSCC提供了一种有前景的治疗方法。

然而，本研究仍存在一些局限性。例如，尽管tLNPs在HNSCC癌细胞中表现出良好的治疗效果，但其在其他类型癌症中的适用性尚需进一步验证。此外，CRISPR-Cas9系统的脱靶效应也是一个需要关注的问题。在未来的研究中，我们将继续优化tLNPs的制备和递送策略，以降低脱靶效应并提高治疗效率。

03
结论

本研究成功开发了针对头颈癌的EGFR靶向CRISPR-LNP递送策略，并评估了其治疗效果。结果显示，这些tLNPs能够特异性地靶向肿瘤细胞并诱导持久的治疗反应。这一策略为临床上高复发率的实体瘤提供了一种有前景的治疗方法，值得进一步研究和推广。

参考文献：Masarwy, Razan, et al. "Targeted CRISPR/Cas9 lipid nanoparticles elicits therapeutic genome editing in Head and Neck Cancer." Advanced Science (2024): 2411032.