mRNA疗法作为一种新兴的治疗方法，在遗传医学领域展现出巨大潜力，其应用范围涵盖癌症免疫疗法、蛋白替代疗法、基因治疗和疫苗开发。mRNA脂质纳米颗粒（LNPs）通过封装mRNA分子，实现其在体内的高效递送。然而，该领域的技术复杂性和工作流程的多样性为研究人员进入这一领域设置了障碍。本文旨在提供一个易于操作的mRNA LNP体内评估的详细指南，以降低研究门槛，促进学术界、工业界和临床环境中的研究进展。

01
概览

研究使用商业可用的离子化脂质SM-102，基础LNP配方为SM-102、DOPE、胆固醇和C14-PEG-2000，摩尔比为48:10:40:2。通过微流控混合技术制备mRNA- LNP，该技术通过将有机相（包含离子化脂质、磷脂、胆固醇和PEG脂质）与水相（包含mRNA）以可调速率混合，实现批次间的一致性。为了证明方案可以应用于制备和评价各种mRNA LNP配方，实验还制备了添加辅料的mRNA LNPs。并可在基础 mRNA 制剂的有机相中添加其他辅料，如单宁酸 (TA)（摩尔比为 47:9:40:2:2）、聚乙烯亚胺 (PEI)（摩尔比为 46:9:38:1:6）、DC-胆固醇-盐酸盐（DC-Chol）（摩尔比为 45:9:38:1:7）、环孢素（摩尔比为 47:9:40:1:3）或氯化钙（CaCl2）（摩尔比为 33:6:27:1:33），整个脂质混合溶液中有五种成分。还可将其他辅料以 1:1 wt% 的比例与 mRNA 混合加入水相中，如 HIV-TAT 1（TAT，转录肽的反式激活剂，0. 2 mg/mL）、八精氨酸（0.2 mg/mL）、5′-三磷酸腺苷（ATP）（2 mg/mL）和 Na2HPO4（2 mg/mL）稀释在柠檬酸缓冲液（10 mM pH 3）中。

通过尾静脉注射将mRNA LNPs打入6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠体内，评估其体内递送效率、生物分布和耐受性，包括体重保持评估、组织学评估、血液学检测、全血细胞计数（CBC）和肝肾功能的临床化学检测。

图 1 ：mRNA -LNP的配方制定及评估方案概述。

02
体内 mRNA-LNP 的评估实验设计

为了评估 mRNA-LNP 在体内的效力和生物分布情况，使用 C57BL/6 小鼠（雌性，6 - 8 周龄，体重 18 - 21 克），以 0.65 mg/kg的剂量静脉注射不同配方的FLuc mRNA LNP（每组 n = 3），并将荧光分子（DiD）掺入 LNP 中，以便评估生物分布情况。同时，给小鼠注射裸 mRNA 或 PBS 作为对照。24 小时后，给小鼠腹腔注射 d-荧光素，使用体内成像系统（IVIS）对每个解剖器官发出的荧光和发光信号（表明细胞内蛋白质的存在）进行定量，从而观察其生物分布情况。按照步骤 67C 中的程序进行耐受性研究，包括体重评估、组织学评估、全血细胞计数（CBC）的血液学检测以及肝肾功能的临床化学检测。

为了测量 mRNA-LNP 促进蛋白表达的效力，采用了一种携带人促红细胞生成素（EPO）mRNA 的小鼠模型。用 C57BL/6 小鼠通过静脉注射不同配方的 EPO mRNA 脂质纳米颗粒（剂量为 0.65 mg/kg，每组 n = 3）,24 小时后，在室温下对每只小鼠进行心脏穿刺采血，测定血清样本中 EPO 蛋白的浓度。

03
实验步骤

（A）使用 FLuc mRNA LNP 测量生物分布和细胞内蛋白质表达水平

（i）制备 FLuc mRNA LNP，应在有机相中加入 1% 摩尔比的 DiD 标记物以制备 FLuc mRNA DiD-LNP。

（ii）通过尾静脉向 C57BL/6 小鼠静脉注射荧光素酶 mRNA 脂质纳米颗粒（每组至少 n = 3）。

（iii）在注射荧光素酶 mRNA 脂质纳米颗粒后 24 小时，使用 1.5 - 2.5% 的异氟烷对小鼠进行麻醉。

（iv）在注射荧光素酶 mRNA 脂质纳米颗粒后监测小鼠体重，以表明其毒性。比较注射前和注射后 24 小时小鼠的体重。通常，体重减轻不超过注射前体重的 10%被认为是可接受的，表明对治疗有良好的耐受性。体重减轻超过 10%表明对治疗的耐受性差。

（v）腹腔注射 130 μL d-荧光素（30 mg/ml在 DPBS 中）。

（vi）15 分钟后，在室温下通过心脏穿刺采血，每只小鼠采集 60 μL血液到 K2EDTA 管中，采集 190 μL血液到 Minicollect 管中。

（vii）使用二氧化碳吸入法结合辅助安乐死手段（颈椎脱臼法）对小鼠实施安乐死。对于鞋盒式小鼠笼，二氧化碳流量需为 2.8 升/分钟。

（viii）取出并用生物发光和荧光成像系统（IVIS）对器官进行成像（胰腺、脾脏、肝脏、肾脏、卵巢、肺和心脏）。

（ix）使用 AuRA 软件量化发光强度。

（B）使用 EPO mRNA LNP 测量分泌蛋白表达水平

（i）制备 EPO mRNA LNP。

（ii）向 C57BL/6 小鼠（杰克逊实验室，18-21 克）静脉注射 EPO mRNA LNP（每组至少 n = 3）。

（iii）在注射 EPO mRNA LNP 后总共 24 小时，通过心腔穿刺采血法在室温下从每只小鼠采集 200 μL血液至 Minicollect 管中。

（iv）在室温下以 1300g 离心 Minicollect 管 10 分钟以收集血清。

（v）按照制造商的说明，使用人 EPO ELISA 试剂盒测量血清样本中 EPO 蛋白的浓度。

（C）mRNA LNP 毒性的评估

（i）为进行血液学检测和肝肾功能的临床化学检测，将步骤B（iii）中的 Minicollect 管在室温下以 1300g 离心 10 分钟以收集血清。

（ii）使用 Vet Axcel 仪器，分别使用相应的试剂盒，按照制造商的协议测量血清中 ALT、AST、ALP、BUN 或肌酐的水平。

（iii）使用 IDEXX ProCyte Dx 血液学分析仪，按照 CBC 试剂盒的说明对步骤1A（vi）中收集在 K2EDTA 管中的血液样本进行 CBC 检测。

（iv）对第A（viii）步收集的器官进行组织学检测时，首先将组织放入金属模具中，加入温热石蜡覆盖组织，并插入一个盒片以作支撑。如有需要，可再添加石蜡。将模具置于冷却板上，直至组织块凝固。凝固后，从金属模具中取出组织块，并修剪掉多余的石蜡。

（v）在切片机上将组织切成 5 微米厚的切片，置于正电荷载玻片上。

（vi）在进行苏木精和伊红染色之前，将载玻片在空气中干燥过夜，然后在 60°C 下烘烤 30 分钟。

（vii）使用自动染色仪 XL 进行苏木精和伊红染色。将切片用苏木精染色 2 分钟，用伊红-Y 染色 1 分钟。使用澄清剂 2 和蓝化液来区分反应。

（viii）染色完成后，用梯度乙醇（95%）脱水，最后用二甲苯脱水，并用细胞密封剂 60 封片。

（ix）对每个样本进行组织学分析，以评估细胞和组织损伤情况，并观察任何炎症反应，从而帮助确定 mRNA LNP 对不同器官的安全性和潜在不良影响。

04
实验时间安排

mRNA LNP 的体内评估

步骤1A（i - ix），使用 FLuc mRNA LNP 测量生物分布和细胞内蛋白表达水平：2 - 3 天

步骤1B（i - vi），使用 EPO mRNA LNP 测量分泌蛋白表达水平：2 - 3 天

步骤1C（i - ix），评估 mRNA LNP 的毒性：1 - 2 周

05
结果

实验通过向 C57BL/6 小鼠静脉注射荧光素酶（FLuc）或促红细胞生成素（EPO）mRNA-LNP来评估其体内疗效。

结果表明，TAT LNPs 和八精氨酸 LNPs 表现出较低的荧光素酶（FLuc）信号，这与裸 mRNA 和 PBS 对照组相似（图2b、c）。

其次，TA LNPs、PEI LNPs 和 ATP LNPs 表现出较高的 FLuc 表达（图2b、c）。

第三，不含任何辅料的 LNP 制剂主要在肝脏中表达。

第四，各种 mRNA LNP 制剂能够促进不同器官中蛋白质的表达。

第五，分泌到血清中的促红细胞生成素（EPO）表达量与 FLuc 表达量呈现相似的趋势（图2e）。

最后，所有 mRNA LNP 制剂均表现出耐受性，通过体重保持、组织学（图2f）、全血细胞计数（CBC）血液学检测以及检测肝肾功能的血液检测（图2g），包括碱性磷酸酶（ALP）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、血尿素氮（BUN）和肌酐检测进行分析。治疗组中的这些生物标志物结果与 PBS 对照组相似。mRNA LNP 治疗组与裸 mRNA 或 PBS 对照组之间未观察到差异。总的来说，该方案通过评估 mRNA LNP 在体外和体内的性能，有助于设计优化的 mRNA LNP 配方，从而促进全球范围内 mRNA LNP 开发的研究。

表 1：制备的 mRNA LNP 配方详情

图2：mRNA 脂质纳米颗粒的体内评估方法