脂质纳米颗粒（LNPs）作为非病毒核酸递送系统，在临床应用中展现出巨大潜力。然而，LNPs的细胞内转运机制，特别是其如何逃逸内体并释放核酸货物到细胞质中，仍不完全清楚。LNPs通常由可离子化脂质、辅助脂质（如DSPC）、胆固醇和聚乙二醇（PEG）脂质组成。胆固醇在LNPs中扮演多重角色，包括填补粒子间隙、限制LNP-蛋白相互作用和促进膜融合等。然而，胆固醇对LNPs细胞内转运的影响尚未得到充分研究。本研究旨在探究脂质纳米颗粒（LNPs）中胆固醇成分对其细胞内转运效率的影响。通过开发一种基于链霉亲和素-生物素-DNA复合物和高通量成像技术的高灵敏度LNP/核酸追踪平台，我们发现高胆固醇含量显著阻碍了LNPs在细胞内的转运，导致核酸货物无法有效释放到细胞质中，从而降低了递送效率。这一发现为优化LNP配方以提高基因递送效率提供了新的视角。

01
实验方法

抗体与试剂：包括兔抗EEA1抗体（早期内体标记物）、小鼠抗LAMP2抗体（晚期内体/溶酶体标记物）、Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 555标记的羊抗兔和羊抗鼠二抗、DOPE-Atto647（用于脂质标记）、胆固醇、SM102脂质、DSPC脂质、mPEG-DMG脂质等。

核酸材料：使用pUC57质粒作为模板，通过PCR扩增获得约1000 bp的线性DNA，并在PCR过程中掺入生物素标记的dUTP，用于后续与链霉亲和素-FITC复合物结合进行荧光标记。

成像平台：使用高内涵成像系统获取细胞图像，通过多层扫描（间隔1 µm）确保覆盖细胞深度。成像时，可分别观察脂质（DOPE-Atto647标记）、DNA（链霉亲和素-FITC标记）以及特定细胞器（EEA1和LAMP2标记）的荧光信号。

02
实验结果

使用线性DNA作为模型核酸货物，通过免疫荧光分析发现，LNP封装显著改变了核酸的细胞内转运路径。具体而言，与裸DNA相比，LNP/DNA复合物在细胞内呈现不同的分布模式。裸DNA主要滞留在早期内体中，其荧光信号与内体标记物EEA1共定位。而LNP/DNA复合物则在接种后迅速进入细胞，并在核周区域聚集，形成所谓的“溶酶体云”。这表明LNP封装不仅促进了核酸的细胞摄取，还重定向了其细胞内转运路径，使其更接近释放区域。

Fig. 1. LNPs re-route nucleic acid intracellular trafficking.

通过设计一系列具有不同胆固醇含量的LNP配方，并观察其在HeLa细胞中的分布，我们发现高胆固醇含量显著影响了LNPs的细胞内转运。具体而言，当胆固醇含量从基准处方的38.5%摩尔比增加到45%时，内体聚集现象明显加剧；增加到50%时，形成大量微米级聚集体。随着胆固醇含量的增加，外周LNP-内体的数量和大小均显著增加。这些外周LNP-内体主要位于细胞核上方，且荧光信号强度随胆固醇含量的增加而增强。进一步的分析表明，高胆固醇含量导致LNPs在细胞内的滞留时间延长，转染效率显著下降。这些结果表明，高胆固醇含量阻碍了LNPs向释放区域的转运，从而降低了核酸货物的递送效率。

表一、不同胆固醇含量LNP处方表

Fig. 2. Cholesterol aggravates formation and fusion of peripheral LNP-endosomes.

为了探究如何缓解胆固醇对LNPs细胞内转运的阻碍作用，我们进一步研究了辅助脂质DSPC的影响。通过设计一系列具有不同DSPC含量的LNP配方，并观察其在HeLa细胞中的分布，我们发现DSPC能够显著缓解胆固醇诱导的外周LNP-内体聚集。随着DSPC浓度的增加（如从基准处方的10%摩尔比增加到20%、30%等），胆固醇诱导的内体形成得到显著缓解。外周LNP-内体的数量和大小均有所减少，且LNPs的细胞内转运和转染效率得到提高。这些结果表明，DSPC作为辅助脂质，在LNPs的细胞内转运中发挥了重要作用，能够缓解胆固醇的负面效应。

表二、不同胆固醇含量LNP处方表

Fig. 3. DSPC alleviates formation of peripheral LNP-endosomes induced by cholesterol.

03
讨论

本本研究首次揭示了胆固醇对LNPs细胞内转运的阻碍作用。高胆固醇含量导致外周LNP-内体聚集，阻碍了LNPs向释放区域的转运，从而降低了核酸货物的递送效率。DSPC作为辅助脂质，能够缓解胆固醇的负面效应，提高LNPs的细胞内转运和转染效率。这些发现为优化LNP配方以提高基因递送效率提供了新的策略。

04
结论

本研究表明，胆固醇是LNPs细胞内转运的重要调节因子。通过优化LNP配方中的胆固醇和DSPC比例，可以提高LNPs的细胞内转运效率和基因递送效率。未来的研究应进一步探讨胆固醇在LNPs中的作用机制，以及如何通过调整LNP配方来最大化其递送效率。