脂质纳米颗粒（LNPs）作为mRNA递送的高效载体，由电离脂质、磷脂、胆固醇和可脱落的PEG脂质组成。mRNA-LNPs通过与载脂蛋白E（ApoE）结合，经细胞膜上的ApoE受体介导的内吞作用进入细胞，随后电离脂质促进内体逃逸，释放mRNA至细胞质中，诱导外源蛋白的高效表达。目前，mRNA-LNPs的制备主要采用溶剂稀释法，其中mRNA溶于酸性缓冲液，脂质溶于有机溶剂后混合。乙醇是最常用的有机溶剂，但其对mRNA-LNPs性能的影响尚缺乏系统研究。本研究系统地探索了制备mRNA-LNPs过程中溶解脂质的有机溶剂对其性质和功能的影响。通过筛选多种有机溶剂，我们发现吡啶作为溶剂能够显著提升mRNA-LNPs的质量和体外、体内功能。吡啶适用于多种脂质组合，并可兼容微流控制备技术。此外，经过适当纯化后，mRNA-LNPs中残留的吡啶量极低，不影响其安全性。尽管需进一步机制研究，但本研究表明吡啶是一种比乙醇更适合用于mRNA-LNP生产的溶剂。

01
材料与方法

本研究使用了多种脂质成分，包括SM-102、Dlin-MC3-DMA、DOPC、DSPC、DOPE和DMG-PEG2000等。有机溶剂包括乙醇、甲醇、1-和2-丙醇、乙腈、DMF、DMSO、丙酮、吡啶、1,4-二氧六环、叔丁醇、四氢呋喃、吗啉、4-甲基吡啶、吡咯烷、哌啶和胆固醇等。细胞系包括人肺癌细胞系A549和人肝癌细胞系HepG2。动物实验采用ddY雄性小鼠。

脂质溶于有机溶剂中，mRNA溶于50 mM柠檬酸缓冲液（pH 3）中。通过涡旋或微流控设备混合脂质和mRNA溶液，随后进行透析和超滤纯化。通过测量mRNA的包封效率（EE）来评估LNPs的制备效果。

将编码萤火虫荧光素酶（fLuc）的mRNA-LNPs加入A549和HepG2细胞中，24小时后检测荧光素酶表达水平。

通过尾静脉注射fLuc编码的mRNA-LNPs至小鼠体内，6小时后检测各器官中的荧光素酶表达水平。同时，监测血液中Gluc编码的mRNA-LNPs的表达水平以评估时间依赖性。

02
实验结果

在制备mRNA-LNPs的过程中，我们系统地探索了多种有机溶剂对LNPs理化性质的影响。具体结果如下：

粒径（Size）：不同有机溶剂制备的mRNA-LNPs粒径差异显著。例如，在乙醇、甲醇、乙腈、DMF、DMSO、丙酮、二氧六环和吗啉等溶剂中，mRNA-LNPs的粒径通常在70-100 nm之间。然而，使用2-丙醇和吡啶作为溶剂时，LNPs的粒径较大，分别为154.2 ± 10.0 nm和132.9 ± 7.5 nm。特别地，1-丙醇、叔丁醇、四氢呋喃、4-甲基吡啶、吡咯烷和哌啶等溶剂制备的LNPs粒径超过200 nm，表明这些溶剂可能不适合用于mRNA-LNPs的制备。

多分散指数（PDI）：PDI是衡量LNPs粒径分布均匀性的重要指标。研究发现，使用吡啶制备的mRNA-LNPs具有较低的PDI值（0.11 ± 0.02），表明其粒径分布高度均一。相比之下，乙醇制备的LNPs PDI值为0.24 ± 0.03，虽然也在可接受范围内，但略高于吡啶制备的LNPs。

包封效率（EE）：几乎所有测试的有机溶剂（如乙醇、甲醇、2-丙醇、乙腈、DMF、DMSO、丙酮、吡啶、二氧六环和吗啉）都能实现接近100%的mRNA包封效率。然而，1-丙醇、叔丁醇、四氢呋喃、4-甲基吡啶、吡咯烷和哌啶等溶剂制备的LNPs包封效率显著降低，表明这些溶剂可能不利于mRNA的稳定包封。

Table 1 Physicochemical properties of mRNA-LNPs prepared using different organic solvents. 

为了评估不同有机溶剂制备的mRNA-LNPs的体外转染效率，我们在A549和HepG2细胞系中进行了萤火虫荧光素酶（fLuc）表达实验。具体结果如下：

A549细胞：与乙醇制备的mRNA-LNPs相比，吡啶制备的LNPs显著提高了fLuc的表达水平（p < 0.001）。此外，随着吡啶在混合溶剂（乙醇与吡啶）中比例的增加，fLuc表达水平也逐渐提高，并在吡啶比例为75%时达到平台期。

HepG2细胞：虽然吡啶制备的mRNA-LNPs在HepG2细胞中提高fLuc表达水平的趋势不如A549细胞显著，但仍表现出高于乙醇制备LNPs的转染效率（p < 0.05）。

Fig. 1. Effect of organic solvent dissolving lipid on the mRNA transfection efficiency of mRNA-LNPs.

为了验证吡啶作为溶剂的通用性，我们将其应用于多种脂质组合和微流控制备技术中。具体结果如下：

不同脂质组合：吡啶适用于多种磷脂（如DOPC、DSPC、DOPE）和电离脂质（如SM-102、ALC-0315、DLin-MC3-DMA）组合制备的mRNA-LNPs。尽管在某些组合中（如ALC-0315与吡啶组合），包封效率略有下降，但转染效率仍显著提高。

Fig. 2. Effect of pyridine concentration on the mRNA transfection efficiency of mRNA-LNPs. SM-102, phospholipids (DOPC, DSPC, or DOPE), cholesterol, and DMGPEG (50/10/38.5/1.5 (mol%)) were dissolved in a mixed organic solvent containing pyridine and ethanol at any proportions.

Fig. 3. mRNA transfection efficiency of mRNA-LNPs prepared using ethanol or pyridine Ionizable lipids (SM-102, ALC-0315, or Dlin-MC3-DMA), DOPC, cholesterol, and DMG-PEG (50/10/38.5/1.5 (mol%)) were dissolved in ethanol or pyridine.

Fig. 4. mRNA transfection efficiency of mRNA-LNPs prepared with microfluidics device. Ionizable lipids (SM-102, ALC-0315, or Dlin-MC3-DMA), DOPC, cholesterol and DMG-PEG were dissolved in ethanol or pyridine.

为了评估吡啶制备的mRNA-LNPs在体内的功能，我们通过尾静脉注射fLuc编码的LNPs至小鼠体内，并检测各器官中的荧光素酶表达水平。具体结果如下：

器官分布：吡啶制备的mRNA-LNPs在肝脏、肾脏和肺中的fLuc表达水平显著高于乙醇制备的LNPs（p < 0.05）。然而，在脾脏中，两种LNPs的fLuc表达水平无显著差异。

时间依赖性：我们还监测了血液中Gluc编码的mRNA-LNPs的表达水平以评估其时间依赖性。结果显示，吡啶制备的LNPs在注射后1-48小时内Gluc表达水平显著高于乙醇制备的LNPs（p < 0.05），且其曲线下面积（AUC）也更高。

AST和ALT水平：注射mRNA-LNPs后，小鼠血浆中的AST和ALT水平均在正常范围内，且吡啶制备的LNPs与乙醇制备的LNPs之间无显著差异。这表明吡啶制备的mRNA-LNPs具有良好的生物相容性和安全性。

Fig. 5. In vivo evaluation of mRNA-LNPs prepared using ethanol or pyridine SM-102, DOPC, cholesterol, and DMG-PEG were dissolved in either ethanol or pyridine. mRNA-LNPs were prepared using a microfluidic device.

为了评估mRNA-LNPs中残留的吡啶量是否影响其安全性，我们使用气相色谱-质谱法（GC-MS）进行了检测。经过适当纯化后，mRNA-LNPs中残留的吡啶量极低，远低于国际协调会议（ICH）指南规定的最大允许限量200 ppm。这表明吡啶在mRNA-LNP制备过程中的使用是安全的，不会因残留溶剂而影响产品的质量和安全性。

Fig. 6. Residual pyridine in mRNA-LNPs prepared using pyridine SM-102, DOPC, cholesterol, and DMG-PEG were dissolved in pyridine.

03
讨论

本研究首次系统地探索了制备mRNA-LNPs过程中溶解脂质的有机溶剂对其性质和功能的影响。吡啶作为溶剂能够显著提升mRNA-LNPs的质量和转染效率，这可能与其对脂质溶解性和混合过程中pH值的影响有关。尽管吡啶制备的mRNA-LNPs粒径较大，但其高度均一性和高效转染效率表明其在mRNA递送系统中的巨大潜力。

此外，吡啶的通用性和微流控制备兼容性进一步扩展了其在mRNA-LNP生产中的应用前景。安全性评价结果表明，吡啶制备的mRNA-LNPs具有良好的生物相容性，残留的吡啶量远低于安全限量。

然而，本研究尚未揭示吡啶提升mRNA-LNP功能的具体机制。未来的研究将进一步探索吡啶对mRNA-LNP微结构的影响，以及其在不同递送系统中的应用潜力。

04
结论

本研究表明，吡啶作为溶解脂质的有机溶剂能够显著提升mRNA-LNPs的质量和体外、体内功能。吡啶制备的mRNA-LNPs具有高度均一性和高效转染效率，且适用于多种脂质组合和微流控制备技术。经过适当纯化后，mRNA-LNPs中残留的吡啶量极低，不影响其安全性。尽管需进一步机制研究，但吡啶作为一种比乙醇更适合用于mRNA-LNP生产的溶剂，具有广阔的应用前景。