基于脂质的药物递送系统在递送小分子、蛋白质和核酸方面具有广泛应用。特别是LNPs，在mRNA递送中占据主导地位，这得益于mRNA-LNP COVID-19疫苗的成功应用。然而，mRNA-LNP的制造过程复杂且对工艺敏感，需要系统化的工艺开发方法，包括数学建模和统计分析，以确保从实验室规模到工业规模的可扩展性和产品质量。本文研究了mRNA-LNP制造过程中切向流过滤（TFF）和无菌过滤的工艺开发，重点探讨了膜性能及过滤模型。通过测试不同TFF膜材料和工艺参数，优化了TFF过程以提高mRNA-LNP的浓度，并分析了无菌过滤过程中过滤模型的应用，为大规模生产提供了设计空间。本研究结果有助于开发稳健且可扩展的mRNA-LNP制造工艺，确保产品质量。

01
材料与方法

本研究使用由Providence Therapeutics Holdings Inc.提供的编码SARS-CoV-2刺突蛋白的mRNA，浓度为2 mg/mL。脂质混合物包括一种专有离子化脂质、胆固醇、DSPC、DMG-PEG2000等，均购自商业供应商。

mRNA和脂质溶液通过微流控快速混合，形成LNPs，随后通过PBS稀释稳定。

使用Sartorius Stedim的Sartoflow SMART TFF系统，测试了Hydrosart ECO和Ultracel两种TFF膜材料。在不同流量下进行TMP实验，评估膜性能。

使用Sartorius Stedim的Sartoscale 25滤器进行无菌过滤实验，评估不同滤膜材料和预滤器孔径对滤器容量的影响。

使用DLS分析LNPs的粒径和分散性指数（PDI），通过Ribogreen分析测定mRNA的封装效率和总浓度。

使用Huh-7细胞进行体外转染实验，通过ELISA分析转染后细胞中COVID-19刺突蛋白的表达水平。

02
结果与讨论

在切向流过滤（TFF）过程中，研究评估了Hydrosart ECO和Ultracel两种膜材料在不同流量（3, 4, 和5 L/m²/min）下的跨膜压（TMP）实验。实验结果显示，Hydrosart ECO膜在所有测试流量下均表现出更高的渗透通量和更短的工艺时间。具体而言，在5 L/m²/min的流量下，Hydrosart ECO膜的渗透通量约为100 LMH，而Ultracel膜的渗透通量约为80 LMH，表明Hydrosart ECO膜在mRNA-LNP过滤中具有更高的效率和性能。此外，归一化水渗透性（NWP）测试显示，两种膜在使用前后NWP值无明显差异，证实了膜的完整性和有效清洁。然而，Hydrosart ECO膜在过程中的实际表现优于Ultracel膜，这可能与其较低的LNP-膜相互作用有关，从而减少了膜污染和吸附现象。

Fig. 1. TMP excursion experiments at various feed fluxes using (A) Hydrosart ECO and (B) Ultracel membranes. (C) Normalized water permeability (NWP) at 22 ◦C before and after TFF processing. (D) Spike protein expression after Huh-7 cells transfection with mRNA-LNPs, fitted with a logistic 4-parameter function. (E) Particle size (nm) and PDI, and (F) encapsulation efficiency of post-TFF samples processed with different membranes.

为了描述mRNA-LNP过滤过程中的通量衰减，研究评估了四种常见的过滤模型：完全阻塞模型、逐渐堵塞模型、中间阻塞模型和滤饼过滤模型。通过将实验数据与这些模型进行拟合，发现逐渐堵塞模型提供了最佳拟合效果，其Akaike信息准则（AIC）值最低，R²值最高。逐渐堵塞模型表明，随着过滤的进行，颗粒逐渐在膜孔内积累，导致通量逐渐下降，这与研究在实验中观察到的现象一致。相比之下，完全阻塞模型和滤饼过滤模型未能准确描述mRNA-LNP过滤过程中的通量衰减行为。

Fig. 2. Volumetric throughput (v) versus filtration time (t) fitting models for mRNA LNPs filtration using Sartopore 2 XLG filter under constant pressure

在无菌过滤过程中，研究测试了不同滤膜材料和预滤器孔径对滤器容量的影响。实验结果显示，预滤器孔径对滤器容量有显著影响。具体而言，使用较大孔径（如0.8 µm）的预滤器可以显著提高滤器容量。例如，在相同条件下，使用0.8 µm预滤器的Sartopore 2 XLG滤器相比使用0.45 µm预滤器的滤器，滤器容量提高了约10倍。此外，通过SEM观察滤膜表面，研究发现较小孔径的预滤器在过滤后膜孔堵塞更为严重，这进一步证实了预滤器孔径对滤器容量的影响。

在重复过滤实验中，研究使用之前已通过Sartopore 2 XLG滤器过滤的产品进行再次过滤，发现滤器容量进一步提高，表明大部分污染物已在首次过滤中被去除。这一发现对于优化无菌过滤工艺具有重要意义，因为它表明在实际生产中，可以通过增加预过滤步骤来提高滤器使用效率，从而降低生产成本。

Table 2 Filter capacity (vmax) and Initial flux (J0) for various filter types at different filtration stages. 1.0 mg/mL mRNA-LNPs filtration was performed at a constant pressure of 68.9 kPa. Refiltration experiments were conducted using a product previously filtered through a Sartopore 2 XLG filter

Fig. 3. Plot of volumetric throughput (v) versus filtration time (t) during mRNA-LNP filtration, comparing different filter types and filtration stages. Solid lines represent gradual plugging model fits to the experimental data. Refiltration experiments were conducted using product previously filtered through a Sartopore 2 XLG filter.

Fig. 4. SEM images of Sartoscale 25 filters used for filtering 1 mg/mL mRNA-LNP drug product: Outlet side of the Sartopore 2 XLG 0.8 µm layer (A) before and (B) after use; outlet side of the Sartopore 2 0.45 µm layer (C) before and (D) after use; inlet side of the Sartopore 2 XLG 0.2 µm layer (E) before and (F) after use; inlet side of the Sartopore 0.2 µm layer (G) before and (H) after use.

研究研究了不同mRNA-LNP浓度（0.25, 0.5, 1.0, 和1.5 mg/mL）对过滤过程的影响。实验结果显示，随着mRNA-LNP浓度的增加，滤器容量显著降低。具体而言，在137.9 kPa的恒定压力下，1.5 mg/mL的mRNA-LNP溶液的滤器容量仅为1.91 L/m²，而0.25 mg/mL的溶液滤器容量则高达14.4 L/m²。这可能是由于高浓度溶液具有较高的粘度，增加了过滤过程中的阻力。此外，随着浓度的增加，初始过滤通量也显著降低，进一步证实了粘度对过滤过程的影响。

Fig. 5. Filtrate flux (J) versus volumetric throughput (v) of mRNA LNP with various mRNA concentrations using Sartopore 2 XLG under a constant pressure of 137.9 kPa.

研究研究了不同过滤压力（34.5, 68.9, 103.4, 和137.9 kPa）对滤器容量的影响。实验结果显示，随着过滤压力的增加，滤器容量先显著增加后趋于平稳。具体而言，在103.4 kPa和137.9 kPa的压力下，滤器容量无显著差异。这一发现表明，在实际生产中，通过增加过滤压力可以在一定程度上提高滤器容量，但过高的压力可能不会带来额外的收益。此外，研究还发现初始过滤通量与过滤压力呈线性关系，符合达西定律。

Fig. 6. (A) Particle size distribution graphs by intensity of post-filtration samples at different filtration pressure (B) Contour plot of estimated volumetric throughput (v) as a function of filtration time (t) and filtration pressure (p). The gradual plugging model was extended to v = f (t, p) based on the experimental data, incorporating the effect of filtration pressure.

通过Cryo-TEM观察优化后的工艺参数生产的mRNA-LNP，研究发现粒子呈球形，具有均匀的粒径分布（约50 nm）和清晰的电子致密核心。此外，部分粒子表面观察到小的月牙形突起（blebs），这可能与mRNA与脂质的不完全结合有关。然而，这些blebs并未对mRNA-LNP的体外转染效率产生显著影响（未展示数据）。DLS分析显示，优化后的mRNA-LNP的Z平均粒径为79.9 nm，PDI为0.072，表明粒子具有较高的均匀性。Ribogreen分析显示，mRNA的封装效率高于95%，表明在优化后的工艺参数下，mRNA得到了有效的封装和保护。最终产品的这些特性证明了优化后的工艺参数能够生产出高质量的mRNA-LNP。

Fig. 7. Cryogenic transmission electronic microscopy (Cryo-TEM) images of mRNA-LNPs after one freeze–thaw cycle (A and B). A few particles show bleb structures (black arrows).

03
结论

本研究系统地评估了mRNA-LNP制造中TFF和无菌过滤的工艺开发，发现Hydrosart ECO膜在TFF过程中表现出色，逐渐堵塞模型最适合描述过滤过程。通过优化预滤器孔径和过滤压力，显著提高了滤器容量和过滤效率。本研究结果为mRNA-LNP的大规模生产提供了有价值的见解，有助于开发稳健且可扩展的制造工艺。