自2018年首个LNP获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准以来，LNPs迅速成为生物制药行业首选的药物递送平台。特别是在COVID-19疫苗的开发中，LNPs的应用加速了这一趋势。LNPs的靶向递送通常通过两种方法实现：一种是将LNPs与针对特定靶细胞表位的亲和配体（如抗体）结合；另一种是通过筛选大量LNP配方，寻找具有特定器官趋向性的“物理化学靶向”LNPs。后者因易于体内筛选和高效制造过程，在过去十年中成为学术界和工业界实现靶向递送的主导方法。

然而，本研究在测试具有肺部趋向性的正电荷LNPs作为治疗剂时，意外发现这些LNPs能诱导严重的血栓形成。尽管纳米粒子毒性的研究主要集中在补体蛋白和免疫球蛋白上，但凝血系统作为血浆的第三大防御系统，其被激活后可能产生最致命和急性的后果，却往往被忽视。本文深入探讨了这些LNPs诱导血栓形成的机制，并提出了多种解决方案，以在确保LNPs肺部靶向性的同时减轻其诱导的血栓形成风险。

01
实验结果

在本研究中，我们制备了具有肺部趋向性的正电荷脂质纳米颗粒（+DOTAP LNPs），并通过尾静脉注射至小鼠体内，以评估其诱导血栓形成的能力。实验结果显示，静脉注射+DOTAP LNPs后，小鼠肺部出现明显的血栓形成现象。具体而言，小鼠肺部组织在注射+DOTAP LNPs后30分钟内，呈现出类似“肝样化”的外观，表现为肺部组织颜色鲜红且质地坚硬（图1d）。此外，通过测量小鼠注射LNPs后的活动距离，我们发现+DOTAP LNP注射组小鼠的活动能力显著降低，表明这些小鼠出现了明显的乏力症状（图1e）。

为了进一步量化+DOTAP LNPs诱导的肺损伤，我们收集了小鼠的支气管肺泡灌洗液（BALF），并测量了其中的蛋白质和白细胞计数。结果显示，随着+DOTAP LNP注射剂量的增加，BALF中的蛋白质和白细胞计数均显著上升，表明+DOTAP LNPs导致了肺部毛细血管渗漏和炎症反应（图1f）。特别地，在预先存在肺部炎症的小鼠模型中（通过雾化吸入脂多糖LPS诱导），+DOTAP LNPs诱导的肺部损伤更为严重，BALF中的蛋白质浓度较对照组高出近6倍（图1g）。

Figure 1. Cationic LNPs with physicochemical tropism to the lungs induce acute, severe side effects in mice.

为了探究+DOTAP LNPs诱导血栓形成的机制，我们进行了一系列凝血相关指标的检测。首先，通过肺组织切片染色，我们发现+DOTAP LNP注射组小鼠的肺部大血管和毛细血管中均存在大量血栓（图2a）。进一步地，我们测量了小鼠血浆中的凝血酶-抗凝血酶复合物（TAT）水平，这是凝血激活的标志物。结果显示，+DOTAP LNP注射组小鼠的血浆TAT水平较对照组显著升高，且这一效应在预先存在肺部炎症的小鼠中更为显著（图2b）。

为了确定+DOTAP LNPs激活凝血的具体途径，我们进行了凝血酶原时间（PT）和活化部分凝血活酶时间（APTT）的检测。PT主要反映外源性凝血途径的激活情况，而APTT则主要反映内源性凝血途径的激活情况。实验结果显示，+DOTAP LNPs对PT无显著影响，但显著缩短了APTT（图2e-g），表明+DOTAP LNPs主要通过激活内源性凝血途径诱导凝血。

为了直接证明+DOTAP LNPs对血小板的激活作用，我们进行了流式细胞术分析。结果显示，+DOTAP LNP处理后的血小板表面P-选择素（CD62p）的表达显著增加，表明血小板处于高度激活状态（图3i）。此外，我们还发现+DOTAP LNPs能够与血小板紧密结合，且这种结合作用显著促进了血小板的激活（图3j, k）。

Figure 2. Coagulation is activated by positively charged LNPs and other nanoparticles, across diverse formulations, both in vivo and in ex vivo whole blood.

Figure 3. DOTAP LNPs cause platelet activation.

为了进一步探究+DOTAP LNPs激活凝血的机制，我们进行了纤维蛋白原结合实验。通过荧光标记的纤维蛋白原与+DOTAP LNPs共孵育，并使用纳米粒子跟踪分析（NTA）检测纤维蛋白原在LNPs上的聚集情况。结果显示，+DOTAP LNPs能够显著促进纤维蛋白原在其表面的聚集（图4b-d）。进一步地，我们通过放射性标记的纤维蛋白原和LNPs在小鼠体内的分布实验，发现+DOTAP LNPs能够显著增加肺部纤维蛋白原的摄取量（图4e-g）。

为了证明纤维蛋白原在+DOTAP LNPs诱导凝血中的作用，我们使用组织型纤溶酶原激活剂（tPA）预处理血浆以消耗纤维蛋白原。结果显示，在纤维蛋白原耗尽的血浆中，+DOTAP LNPs对血小板的激活作用显著减弱（图4l），表明纤维蛋白原在+DOTAP LNPs诱导的凝血过程中起着关键作用。

Figure 4. Fibrinogen binds to +DOTAP LNPs, is required for LNP-induced activation of platelets, and is likely the first step in LNP-induced clotting.

为了验证我们提出的解决方案的有效性，我们进行了抗凝治疗和LNP表面修饰实验。首先，通过预先使用直接凝血酶抑制剂比伐芦定处理小鼠，我们发现比伐芦定能够显著减轻+DOTAP LNPs诱导的血栓形成，同时保留其肺部靶向性（图5a-d）。其次，通过将直接凝血酶抑制剂PPACK共价结合到+DOTAP LNPs表面，我们也成功防止了血栓的形成（图S16d，支持信息）。

此外，我们还发现通过减小+DOTAP LNPs的尺寸至约80nm以下，可以显著减少纤维蛋白原在其表面的聚集，从而防止血栓的形成（图6）。具体来说，80nm的+DOTAP LNPs在体外实验中几乎不与纤维蛋白原结合（图6c, d），且在体内实验中不会导致肺部纤维蛋白原摄取量的显著增加（图6e, f），也不会在小鼠肺部诱导明显的血栓形成（图6h）。同时，80nm的+DOTAP LNPs仍然能够保留其肺部靶向性，并在肺部有效表达mRNA（图6i, j）。

Figure 5. Anticoagulation ameliorates the side effects of DOTAP LNPs, but only select anticoagulants still allow LNP targeting to the lungs.

Figure 6. Decreasing the size of DOTAP LNPs prevents fibrinogen binding and the resulting coagulation and platelet activation.

02
讨论

本研究首次揭示了具有肺部趋向性的正电荷LNPs能够诱导血栓形成的现象，并提出了多种解决方案以减轻这一风险。这一发现对LNPs的安全性评估提出了新的要求，即在开发LNPs作为药物递送系统时，必须充分考虑其可能诱导的凝血风险。

未来研究应进一步探讨其他纳米粒子特性（如机械性能、表面流动性、聚合物刷边界和附加蛋白质等）与血栓形成之间的关系，并优化现有的抗血栓技术，以确保正电荷LNPs在临床应用中的安全性。

03
结论

本研究通过深入探讨具有肺部趋向性的正电荷LNPs诱导血栓形成的机制，提出了多种有效的解决方案。这些发现不仅为LNPs的安全性评估提供了新的视角，也为开发更安全、更有效的纳米药物递送系统奠定了基础。