嵌合抗原受体（CAR）工程免疫细胞疗法在癌症治疗领域取得了显著进展。传统的体外细胞制造过程复杂，且对患者的选择有严格要求。体内CAR工程作为一种新兴的疗法，具有生产流程简单、消除患者特异性制备需求、降低成本和简化物流运输等优势。大量临床前研究结果推进了其在实体瘤等难治性疾病治疗中的进展，并推动了更加先进产品的开发，以增强体内CAR工程的疗效、细胞治疗的持续性和安全性。本文总结了当前体内CAR工程的方法，包括基于纳米颗粒和病毒的递送系统以及生物指导性可植入支架，并讨论了它们的优缺点。此外，我们还对体内和传统体外CAR工程方法进行了系统比较，并探讨了体内CAR工程面临的挑战和未来前景。

01
引言

CAR-T细胞疗法在癌症免疫治疗中取得了重大突破，七种FDA批准的CAR-T细胞产品在治疗易复发或难治性急性淋巴细胞白血病、B细胞淋巴瘤和多发性骨髓瘤方面展示了卓越的临床疗效。目前，所有FDA批准的CAR-T细胞产品均基于体外工程的自体T细胞。这一过程涉及从患者体内分离T细胞，使用慢病毒或逆转病毒将CARs基因改造到这些细胞中，并在回输前给予患者淋巴细胞清除性预处理，以减少竞争免疫细胞并增强CAR-T细胞的生存、扩增和抗肿瘤效果。然而，为每位患者制造定制T细胞产品的复杂性和高成本是急需解决的问题。为解决体外制造问题，研究者开发了一种方法，使用来自健康供体的“现成”的异体CAR工程细胞产品。这种方法制造能够冷冻保存的产品，需要时可立即取出使用，并且有标准化的制造流程、充足的细胞修改时间和通过工业流程降低成本等优势。然而，异体CAR-T细胞存在致命的移植物抗宿主病（GvHD）风险。因此，需要一种新方法来工程化CAR-T细胞，以提供强大的癌细胞杀伤能力，同时减少制造成本和复杂性。直接在体内生成CAR-T细胞是解决当前体外生成的自体和异体CAR-T细胞疗法问题的有前景的替代方案。体内CAR-T细胞疗法能够促进体内生成CAR工程免疫细胞，将实现治疗药物的简化生产，消除患者特异性制造要求和简化物流，从而节省成本并缩短治疗时间。此外，使用非整合载体的体内方法可能比体外永久基因修饰的CAR-T细胞在避免T细胞耗竭和安全性问题方面具有优势。目前还在探索其他免疫细胞（包括自然杀伤细胞、单核细胞和巨噬细胞）的体内工程策略。在本综述中，讨论了T细胞和其他免疫细胞的体内CAR工程当前策略，并对体内CAR工程和传统体外CAR工程进行了比较。还探讨了体内CAR工程技术的未来发展方向和潜在应用。

图1：体外自体和异体CAR-T细胞疗法与体内CAR-T细胞疗法的概述

表1：针对临床前模型中T细胞体内嵌合抗原受体（CAR）工程改造策略概述

表1（续）：针对临床前模型中T细胞体内嵌合抗原受体（CAR）工程改造策略概述

表2：体内其他免疫细胞CAR工程改造的应用概述

目前，有多种策略在临床前探索体内生成CAR-T细胞的方法。这些方法包括使用脂质纳米颗粒（LNP）包裹核酸（mRNA或质粒DNA）、聚合物纳米颗粒包裹核酸（mRNA或质粒DNA）、慢病毒或腺相关病毒（AAV）递送系统以及生物指导性可植入支架。

LNPs技术利用了已经确立的临床制造基础设施，如COVID-19疫苗大规模生产的成功案例所示。其获得FDA批准也证实了其安全性，并突出了其在体内CAR工程等更广泛治疗应用中的潜力。给药后，LNPs-mRNA通过内吞作用被各种类型细胞摄取，当通过静脉注射时，主要被肝细胞摄取。细胞摄取后，mRNA从内质网逃逸并进入细胞质，在那里被翻译，然后降解。连接到LNPs表面的抗体可以促进其被特定细胞类型摄取。由于mRNA仅限于细胞质，本质上不稳定，不能整合到基因组中，并在细胞分裂期间被稀释，因此使用LNPs-mRNA的方法疗效是短暂的。因此，使用LNPs-mRNA的体内CAR工程疗法可能需要频繁的连续给药以维持治疗效果。临床前研究表明，使用LNPs-mRNA技术进行体内CAR-T细胞工程在癌症免疫治疗中具有巨大潜力。以这种方式产生的CAR-T细胞的短暂性质可能限制潜在毒性，并可以精确给药，且不需要在注射前进行淋巴细胞清除。目前，大多数通过LNPs体内生成CAR-T细胞的研究，将靶向CD3、CD4、CD5、CD7和CD8的抗体或单链可变片段（scFvs）整合到LNPs中。抗体标记的LNPs（以及下面讨论的聚合物纳米颗粒）具有独特的药代动力学和药效学特性。在静脉注射后4小时，非靶向纳米颗粒主要流向肝脏，而通过CD3或CD8靶向的纳米载体主要富集在T淋巴细胞的组织（如脾脏、淋巴结和骨髓）中。纳米载体与靶标细胞的特定相互作用反映了其药代动力学和药效学特性。通过将LNPs靶向免疫细胞（如T细胞、NK细胞、巨噬细胞），可以增强其LNP摄取，从而改变药代动力学和药效学特性并提高治疗效果。然而，与靶向基团的共价连接使制造复杂化，降低颗粒产量和稳定性，并且产品不能在冷冻状态下长期储存。在小鼠身上进行的临床前研究中，使用了经过马来酰亚胺修饰、并结合了针对CD3、CD5或CD7的抗体片段的脂质纳米颗粒（LNPs），这些脂质纳米颗粒用于传递编码针对CD19的嵌合抗原受体（CAR）的mRNA（即CD19CAR）。在这一设计中，脂质纳米颗粒表面的马来酰亚胺的加入促进了通过巯基-马来酰亚胺结合方式与抗体的结合。这种基于LNP的递送系统实现了对脾脏中T细胞的靶向递送，成功实现了CARmRNA递送。虽然没有观察到明显的毒性，研究人员观察到LNP在非T细胞（如巨噬细胞）中表达CAR分子的的脱靶现象。

图2：目前关于T细胞体内CAR工程的策略与机制

PBAE聚合物制剂通过静电相互作用与阴离子核酸（DNA或mRNA）自发组装，并在内吞作用后通过pH依赖性的方式逃出内体。这些聚合物已通过含有微管相关序列和核定位信号的肽进行功能化，以通过微管运输机制促进其遗传物质的快速核导入。PBAE聚合物纳米颗粒是可生物降解的，在‌人免疫系统重建小鼠体内循环中的半衰期较短（1-7小时），在动物模型中已被证明具有良好的耐受性，即使以高浓度进行脑部给药也未显示出毒性迹象。这些纳米颗粒可以通过诸如纳米沉淀、乳液聚合或溶剂蒸发等技术以稳定的形式高效生产。此外，冻干技术使聚合物纳米颗粒能够以干粉形式储存，这便于储存、增强稳定性并降低相关成本。PBAE聚合物纳米颗粒已成功应用于临床前模型中T细胞的体内基因工程操作以及巨噬细胞的体外基因工程操作中。为了将PBAE聚合物纳米颗粒特异性靶向到T细胞，将聚谷氨酸与靶向CD8或CD3的抗体结合，并将结合物通过静电作用吸附到PBAE粒子上。这些靶向纳米颗粒随后可以装载质粒DNA（其设计可以是整合或不整合到基因组中）、转座子DNA（可促进构建体整合到安全位点上）或编码CAR构建体的mRNA。到目前为止，已经对194-1BBzCAR（靶向小鼠CD19）、1928zCAR（靶向人类CD19）、靶向ROR1的CAR以及靶向乙型肝炎病毒的人类T细胞受体（TCR）进行了测试。在临床前白血病、前列腺癌和乙肝诱导的肝细胞癌（HCC）模型中，使用PBAE聚合物纳米颗粒包裹编码人类或小鼠CAR的核酸（mRNA和DNA）成功地进行了T细胞的体内转导，其肿瘤消退效果与传统过继CAR-T细胞疗法相当。然而，使用包裹mRNA的纳米颗粒实现高效CAR工程和抗肿瘤效果需要多次给药，因为CAR表达的短暂性。但是，PBAE聚合物纳米颗粒DNA递送方法存在与转座子介导的基因整合相关的插入突变潜在风险，其临床可行性尚未完全确定。总之，PBAE聚合物纳米颗粒的简单和稳定制造过程简化了储存，降低了成本。这种方法可能代表一种可行、灵活且广泛适用的解决方案，用于在体内诱导CAR-T细胞介导的免疫。但是，PBAE纳米颗粒需要进一步研究其可扩展性、长期生物相容性和潜在毒性。

慢病毒是逆转录病毒的一个亚类，其结构呈球形且有包膜，拥有单链RNA基因组，以能够整合到宿主基因组并从而实现转基因的长期表达而著称。慢病毒载体已被广泛用于将外源基因传递给T细胞。然而，它们在体内感染效率往往受到慢病毒对目标细胞亲和力低以及T细胞通常处于静止状态的限制。为了优化这些载体以用于体内T细胞转导，它们已被用各种病毒包膜进行假型化，包括尼帕病毒、麻疹病毒、辛布斯病毒和共融合糖蛋白的包膜。此外，慢病毒可以被改造从而表达融合到包膜蛋白和其他病毒表面蛋白上的靶向配体，以进一步增强T细胞的亲和性。通过将单链抗体片段（scFvs）或设计的锚蛋白重复蛋白（DARPins）与慢病毒表面表达的糖蛋白复合物进行基因融合，可以创建专门针对特定T细胞亚型的慢病毒载体。

例如，使用针对CD8的scFv特异性抗原结合片段的慢病毒载体，在体内生成了针对CD19的CD8+CAR-T细胞。在注射该载体7天后，30%至50%的CD8+T细胞表达了CAR，并有效地消灭了人源化NSG小鼠体内的人类外周血单核细胞（PBMCs）和Raji淋巴瘤细胞移植的淋巴瘤细胞。此外，当该载体注射到已移植人类CD34+血液干细胞和祖细胞（HSPCs）的小鼠体内时，所生成的CAR-T细胞减少了CD19+B细胞的数量。然而，它们也增加了人类细胞因子的水平，如IL-6、干扰素-γ（IFNγ）和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），这表明产生了细胞因子释放综合征（CRS）。在HSPC移植的人类化小鼠中，CAR-T细胞的生成量低于免疫缺陷的NSG小鼠，这可能是由于髓系细胞对异源病毒颗粒的吞噬作用，从而降低了T细胞中慢病毒的转导效率。另一项研究在NSG小鼠体内测试了一种带有针对CD4特异性DARPin的改良血凝素蛋白的慢病毒载体，该载体在人外周血单个核细胞（PBMCs）经腹腔注射后被引入体内。7天后，该研究实现了约40%至60%的CD4+T细胞的CAR转导率。与采用CD8特异性DARPin以相同方式生成的CD8+CAR-T细胞相比，CD4+CAR-T细胞显示出更高的增殖率，并且能更有效地清除CD19+B细胞，这可能是因为CD8+T细胞在肿瘤负荷较高的情况下更容易出现耗竭现象。

表达抗CD3单链抗体片段并编码CD19嵌合抗原受体（CAR）的慢病毒载体能够使所有T细胞发生转导，这一现象已被证实能够有效生成CAR-T细胞，并在B细胞白血病的小鼠模型中清除恶性细胞。那些以水疱性口炎病毒糖蛋白（VSV-G）进行假型化处理，并包含针对T细胞的CD3特异性单链抗体以实现靶向识别的慢病毒载体，在体内通过腹腔注射和静脉注射的方式也均显示出在生成CAR-T细胞方面的有效性。然而，这些慢病毒载体的生物分布、脱靶效应和免疫原性尚未得到全面评估。不过，这些研究提供了概念验证，即在体内直接注射针对T细胞的慢病毒靶向载体能够成功将CAR转基因传递到足够数量的宿主T细胞中，从而引发治疗反应。慢病毒已被广泛用于体外治疗应用，其临床级生产流程和试剂现已成熟完善，能够实现嵌合抗原受体（CAR）转基因的稳定整合与表达。然而，在体内使用这些载体时，由于病毒的永久性整合，安全性问题愈发突出，引发了关于可控整合、潜在的意外突变以及长期后果的疑问。因此，将慢病毒载体应用于体内治疗需要对靶细胞类型进行严格控制，并且只有在经过严格的安全性评估后，才可考虑将其用于临床试验，然后再获得广泛使用的批准。此外，慢病毒包膜包含一系列宿主细胞膜蛋白，可能会引发免疫反应。这种免疫反应可能会破坏载体在患者血清中的稳定性，妨碍再次给药。开发无同种抗原的慢病毒载体可能是实现体内嵌合抗原受体（CAR）工程的一种有前景的方案，其风险极小且安全性较高，但有关插入性突变的安全性问题仍会存在。

AAV是一种小型、非包膜病毒，具有二十面体衣壳结构和单链DNA基因组，不会整合到宿主基因组中。AAV衣壳可以被工程化以呈现各种蛋白，包括scFvs和DARPins。衣壳的修饰对于实现特定细胞靶向和减少其他细胞的非特异性摄取至关重要。由于其能够实现长期转基因表达和有效纠正疾病表型，同时具有最小毒性，AAV已成为基因递送的关键载体。与慢病毒载体不同，AAV DNA保持稳定的游离形式，抵抗外切核酸酶降解，并利用宿主内质网进行脱壳。这种稳定性和游离存在的能力使AAV成为体内基因操作的合适载体，因为它不会引起插入突变的风险。AAV介导的CAR基因治疗方案已在针对人CD4+ T细胞白血病的人源化小鼠模型中得到测试。在此研究中，AAV载体被设计为递送编码靶向人CD4的scFv以及共刺激受体CD28和4-1BB和CD3ζ TCR亚单位的信号域的线性单链DNA质粒。单次给药这种载体成功产生了能够诱导肿瘤消退的CAR-T细胞。但是，AAV方法持续存在的CAR表达可能在临床中加剧CD4+ T细胞减少症，需要为这种治疗策略开发有效安全开关。尽管如此，AAV潜在应用可能超越癌症和传染病，扩展到自身免疫疾病和器官移植领域。

可植入的多功能藻酸盐支架内已植入病毒载体，用于在体内进行CAR-T细胞工程并实现释放，这是一种介于体内和体外方案之间的混合方案。它们仍需要从患者体内分离出T细胞；但是处理时间缩短至仅一天。与其他体内工程方法不同，藻酸盐支架提供了一个局部且可控的微环境，能够增强T细胞、病毒载体、细胞因子和趋化因子之间的相互作用。这种空间限制提高了CAR转导效率，同时最大限度地减少了与全身性T细胞工程相关的潜在全身性副作用（图2d）。例如，一种基于藻酸盐的支架包含针对人类CD3和CD28的抗体，以及人类IL-2，以促进T细胞增殖。然后将自体外周血单个核细胞（PBMCs）和逆转录病毒接种到支架中，之后进行植入。这种设置有助于病毒载体介导的基因转移，并支持在体内生成和释放功能性的CAR-T细胞。另一种生物引导的可植入支架设计基于胶原蛋白，其中抗人类CD3/CD28抗体、慢病毒以及选定的趋化因子（如CCL21、CCL3、CCL4或CXCL10）连接于此。与接种T细胞不同，这种支架的设计目的是招募、改造、扩增并释放肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）以治疗实体肿瘤。在一种人化的乳腺癌小鼠模型中，先通过腹腔注射人类T细胞，然后将含有人类CCL21、抗CD3/CD28抗体以及一种同时表达抗ROR1CAR的慢病毒的支架植入乳腺中。这种局部放置方式能够直接在肿瘤部位增强T细胞的招募和嵌合改造。总体而言，可植入生物支架技术为体内CAR工程提供了一种新颖的方法，将CAR-T细胞的制造和输送整合到了一个单一的平台上。它为CAR-T细胞的激活、增殖和释放创造了局部的支持性环境。尽管可植生物入支架可能非常适合治疗血液系统恶性肿瘤和可触及的实体瘤，如黑色素瘤和乳腺癌，但它们针对内部或困难的解剖位置的实体瘤（例如，胶质母细胞瘤）的适用性仍待考察。

病毒及其衍生粒子所引发的非靶细胞的意外转导所导致的脱靶效应，可能会对体内基因工程造成重大限制。为了解决这一问题，利用可预测的抗体-抗原相互作用将基因编辑工具特异性地递送到靶标细胞，从而在预定基因组位置进行精确和永久的基因编辑，同时最小化旁观细胞的脱靶效应。该方法使用基于逆转录病毒颗粒的Cas9-EDVs，通过将其与针对CD3、CD4或CD28特异性的scFvs结合，将其靶向T细胞。该方法用于同时体内改造CD19 CAR表达和敲除T细胞受体α恒定区（TRAC）基因座，从而生成同种异体工程T细胞并降低GvHD的风险。与使用与scFv或DARPins相结合的递送载体的其他体内工程策略类似，scFv与抗原的特异性相互作用确保Cas9-EDVs将其有效载荷递送至特定细胞类型。总体而言，与使用病毒载体的体内工程方法相比，该平台能够精确地将分子货物递送至特定细胞类型，从而促进诸如CAR工程和靶向基因敲除等复杂的基因组修饰。然而，还需要进一步的研究来全面评估其在肿瘤根除方面的体内疗效，并解决潜在的安全问题。未来的研究还将侧重于将该技术的应用扩展到非免疫细胞靶点。

预形成的CAR蛋白也可以在体内直接插入T细胞膜。这种方法确保CAR蛋白仅在有限的时间内存在，降低了持续的CAR介导的T细胞活化所导致的细胞因子释放综合征风险，并且不存在插入突变的风险。通过病毒样融合纳米囊泡（FuNVs）实现了工程化蛋白的直接插入，这种纳米囊泡包含一种T细胞融合素，具体来说是一种抗人CD3单链可变片段（scFv），以及一种CAR，例如CD19CAR（图2f）。静脉注射后，FuNVs与T细胞膜融合，并促进CAR整合到T细胞膜中，从而在体内生成CAR-T细胞。

鉴于体内CAR-T细胞工程方法在临床前研究中取得的令人鼓舞的成果，针对其他免疫细胞（特别是自然杀伤细胞、单核细胞和巨噬细胞）的体内工程研究也已展开（表2和图3）。其中，CAR巨噬细胞尤其受到关注。巨噬细胞具有天然的吞噬特性，使其能够高效地内化纳米颗粒，从而提高了其在体内转导的适用性。并且，巨噬细胞具有自然的浸润肿瘤的能力，而肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）是肿瘤微环境（TME）中占主导地位的细胞类型。TAMs在肿瘤进展中发挥着关键作用，通过促进血管生成、转移、免疫抑制和治疗抵抗等机制发挥作用。体内使用嵌合抗原受体（CAR）修饰的巨噬细胞疗法具有极大的潜力，能够通过释放促炎细胞因子和趋化因子，将靶向细胞的促肿瘤性M2极化状态转变为抗肿瘤性M1极化状态，从而增强这些靶向细胞的抗肿瘤活性。

研究人员利用一种新型复合结构成功培养出了CAR-巨噬细胞和CAR-小胶质细胞。该结构旨在将针对神经胶质瘤干细胞的CAR基因递送至巨噬细胞和小胶质细胞中。这一技术使用了表面涂有CA-葡聚糖的均匀纳米微粒来靶向吞噬受体CD206，从而促进CAR-巨噬细胞和CAR-小胶质细胞在体内的生成，这些细胞随后能够识别并消灭神经胶质瘤干细胞。在使用人源化小鼠的神经胶质瘤模型中，这些CAR-巨噬细胞和CAR-小胶质细胞在肿瘤微环境中激发了适应性抗肿瘤免疫反应，并通过诱导长期抗肿瘤免疫来防止术后神经胶质瘤复发。对于脑干神经胶质瘤，研究人员开发了一种合成通用的DNA纳米载体，以实现肿瘤内部递送。这种方法利用了基于可生物降解的PBAE聚合物的纳米颗粒，这些纳米颗粒上修饰有RP-182肽，该肽能与M2型巨噬细胞表面的甘露糖受体CD206结合并激活其功能。这种不含整合元件的CAR基因负载的DNA纳米复合物引入了针对ERBB2的CAR，使得由此产生的CAR巨噬细胞能够在同种异体、原位小鼠模型中持续消灭侵袭性ERBB2阳性的脑干胶质瘤细胞。另一项研究使用了带有甘露糖连接的聚乙烯亚胺（MPEI）来靶向巨噬细胞上的甘露糖受体。

肿瘤内部的基因递送方法对于某些局部的实体肿瘤是有效的，静脉注射的基因递送对于全身性的细胞分布以及转移性癌症的治疗是必不可少的。含有阳离子甲壳素低聚糖-精氨酸（MCA）的脂质体化纳米载体被证明在静脉注射后可靶向肿瘤内巨噬细胞，并可装载编码CAR构建体的DNA。在胰腺癌的小鼠模型中，转染了CAR的巨噬细胞重新激活了其吞噬活性，以靶向肿瘤细胞，并启动了局部区域的抗癌免疫反应。这些脂质体纳米颗粒吸附特定的血浆蛋白，引导它们到达与肝细胞癌相关的巨噬细胞。通过高通量的体内筛选，研究人员已确认氧化脂质纳米颗粒（oLNPs）具有将编码CAR的mRNA递送至单核细胞的能力。oLNP的配方C14-O2具有天然的单核细胞趋向性，并被用于在体内构建功能性的CD19CAR单核细胞。静脉注射C14-O2使健康小鼠出现了明显的B细胞衰竭现象，这凸显了oLNPs作为体内构建CAR巨噬细胞或CAR单核细胞平台的潜力。

其他免疫细胞类型，包括NK细胞、NKT细胞和中性粒细胞，也已被工程化以进行CAR介导的癌症免疫治疗。尽管尚未实现CAR-NK细胞、CAR-NKT细胞或CAR中性粒细胞的靶向体内工程，但由于工程化慢病毒颗粒中单链抗体的CD8α链表达，意外生成了CD19特异性CAR-NK和CAR-NKT细胞。

图3：在临床前模型中对巨噬细胞进行体内嵌合抗原受体（CAR）工程的演示

近年来，CAR技术已扩展到传染病、自身免疫疾病和纤维化之外的癌症领域。例如，针对CD19、BCMA、DSG3和CD20的CAR-T细胞现在被用于靶向自身免疫疾病（如系统性红斑狼疮、多发性硬化症、重症肌无力和类天疱疮）中的自身反应性B细胞。此外，针对HIVgp120糖蛋白的CAR-T细胞疗法目前正在进行两项患者的I/II期剂量递增研究。其他潜在的CAR疗法指征包括哮喘、乙型和丙型肝炎、心脏纤维化、SARS-CoV-2感染和阿尔茨海默病。用于治疗心脏纤维化的体内CAR工程的临床前结果已在小鼠模型中获得。T细胞被工程化以表达针对活化成纤维细胞的纤维母细胞激活蛋白（FAP）的CAR，这些成纤维细胞会硬化心肌并阻碍心脏功能。这通过含有针对CD5的LNPs实现，其中包含FAP-CARmRNA，导致T细胞中FAP-CAR的瞬时表达。心脏切片显示超过一半的心脏CD3+ T细胞表达了FAP-CAR并定位于FAP+成纤维细胞区域，经过治疗的小鼠表现出减少的纤维化和恢复的心脏功能，如超声心动图测量所示。

不同的CAR-T细胞生成方法各有其独特的优势，但也面临独特的挑战。这些挑战包括治疗制造的物流、治疗效果的疗效以及关键的安全性和毒性考虑。鉴于这些平台的多样性，对它们进行比较可以提供对其各自优势和潜在应用的宝贵见解。

表3：体内工程与传统体外自体CAR-T细胞工程的比较

随着商业市场和临床试验中对体外工程化自体CAR-T细胞的需求不断增长，暴露出自体工程化T细胞的生产能力严重不足的缺点。在美国，所有体外生成的自体CAR-T细胞产品目前都在中央设施中进行生产，其周转时间从16天到33天不等，这可能会给患者带来危险的延误。通过扩大规模来缩短生产时间也不可行，因为集中生产活细胞产品涉及复杂的物流问题。也可通过建立更多分散且本地化的生产设施来提高自体细胞疗法的生产能力。但是，与集中式设施相比，本地细胞生产设施成本更高，因为需要专门的设备和昂贵的试剂。体外工程化自体CAR-T细胞疗法的制造和管理成本也非常高昂，这主要是由于其中包含的多步骤流程，包括白细胞分离、基因工程和细胞扩增等环节。相比之下，异体CAR-T细胞方法成为了一种更具成本效益的替代方案。

体内CAR工程策略为自体和异体体外生成的CAR-T细胞提供了极具前景的替代方案，这是因为其“现成可用”的特性简化了释放测试并优化了供应链，从而降低了成本和时间周期，且具有自体性质。使用LNP-mRNA递送方法的体内CAR工程方法最近才进入临床试验阶段，而其他平台，如PBAE聚合物纳米粒子和可植入生物支架方案则处于临床前开发阶段。关于短期、中期和长期的安全性和有效性以及LNP-mRNA、PBAE聚合物-mRNA/DNA和基于AAV的CAR载体能否通过现有生产流程大规模高效生产的问题仍有待探索。此外，由于成本高昂以及复杂的知识产权状况，用于mRNA递送的脂质纳米颗粒的开发和制造仍然面临诸多挑战。AAV载体是基因治疗的优秀的载体，并且显示出强大的安全性，但由于其固有的不稳定性、复杂的生物学和有限的临床数据，其生物工艺开发耗时且具有挑战性。与单克隆抗体等生物药物的成熟平台相比，AAV制造在优化生物工艺、细胞系和分析工具方面仍缺乏技术成熟度。

尽管在液体瘤的治疗中效果显著，但体外生成的自体CAR-T细胞疗法用于治疗实体肿瘤的疗效较为有限。新兴的体内CAR工程方法则提供了一种有前景的替代方案，因为这种方法能够在肿瘤微环境（TME）内持续对治疗性免疫细胞进行改造和扩增。这一动态过程通过克服体外生成的CAR-T细胞所存在的持久性和运输等方面的局限性。此外，与体内生成的CAR-T细胞进行联合治疗可以协同解决诸如免疫抑制性肿瘤微环境和T细胞耗竭等挑战。体内CAR工程方法消除了淋巴细胞清除的需要，从而保护了患者的免疫系统。这种方法可能增强表位扩散，并保持免疫系统识别和靶向肿瘤的能力。体外生成的自体CAR-T疗法通常只针对一种抗原，如果肿瘤细胞在靶向表位上发生突变，这种疗法就可能容易出现肿瘤逃逸的情况。而体内CAR工程则能够利用多重mRNA或病毒载体同时或依次靶向多种抗原，从而降低肿瘤逃逸的风险。

此外，非整合载体的体内CAR-T细胞工程方案可能避免由于慢性刺激引起的CAR-T细胞耗竭。体内CAR工程还允许通过共递送小干扰RNA（siRNA）来临时沉默特定基因或编码细胞因子的mRNA以暂时增强T细胞活性和持久性，而不会出现体外方法中引入多个永久性基因修改导致的风险。这种灵活性允许更加动态的治疗策略，同时减轻TME的免疫抑制效应。尽管具有这些优势，但体内CAR工程在疗效和特异性方面仍面临挑战。与通过受控的体外操作立即提供大量治疗细胞的自体CAR-T细胞相比，体内CAR工程最初生成的CAR-T细胞数量要少得多。这些细胞必须在患者体内随时间逐渐扩增，可能延迟治疗效果。然而，与需要7-22天才能体外生成自体CAR-T细胞相比，一旦完成初始扩增阶段，体内方法可能提供更快的治疗反应。

图4：体内嵌合抗原受体工程的联合疗法

Box1：体内嵌合抗原受体工程的联合疗法

与自体CAR-T细胞疗法相比，体内CAR工程在安全性和毒性方面具有几个显著优势。一是所有体内CAR工程不需要化疗进行淋巴细胞清除，从而避免了相关风险。此外，非整合载体允许实时剂量调整，这可以显著减少毒性和长期副作用，包括CRS和ICANS。mRNA可以在无细胞的情况下生产，具有明确的理化特性，可以最小化产品的变异性。这种受控生产过程确保了临床应用中的质量控制一致性。而体外CAR-T细胞生产通常依赖于整合病毒载体（如慢病毒或逆转病毒），这些载体存在插入突变的风险。基于慢病毒的体内方法存在这种风险，需要在确保疗效和安全性之间取得平衡。与异体CAR-T细胞方法相比，体内CAR工程避免了免疫兼容性问题，从而增强了整体安全性。但体内CAR工程面临几个重要挑战。由于成功到达靶器官或细胞的颗粒有限，通常需要高载体剂量。载体的全身给药可能导致剂量限制性毒性，包括肝损伤。对载体的炎症反应（如补体系统介导的超敏反应）也构成了重大障碍。这些免疫反应也可能通过激活抗原呈递细胞（APCs）、增强细胞因子产生和促进T细胞活化，增强CAR-T细胞扩增和功能性，从而促进抗肿瘤免疫。在临床前模型中，慢病毒载体体内生成的CAR-T细胞显示出增强的炎症细胞因子分泌，并引起了类似CRS的症状。脱靶效应仍然是一个关键问题，因为它可能导致非靶标细胞中意外的CAR表达，可能破坏正常细胞功能并引起不可预见的并发症。尽管慢病毒载体与非整合载体相比提供了更稳定和持久的CAR表达，但它们的永久性整合到宿主基因组中带来了脱靶效应的风险（除了插入突变的风险）。鉴于这些担忧，非整合载体或位点特异性整合载体目前比慢病毒载体更受青睐，以提高体内CAR工程的安全性并最小化基因组干扰。

02
结论

体内CAR工程方法在治疗癌症等疾病方面可能比目前的体外工程自体CAR-T细胞具有成本优势。通过简化的制造流程，它有可能为数百万患者提供各种疾病的实用且可扩展的解决方案。到目前为止，在癌症和心脏损伤模型中的临床前概念验证研究已经证明，通过体内工程生成的治疗细胞与通过传统体外方法生成的细胞在功能上是等效的。这些研究到目前为止仅限于同种异体或人源化小鼠模型。在将体内CAR工程带入临床之前，对各种载体技术进行比较分析是必要的，以确定那些在疗效、免疫原性和安全性之间提供最佳平衡的技术。技术障碍包括优化靶向细胞特异性、实现受控的基因编辑和减少脱靶效应。对于基于纳米颗粒的方法，CAR表达的短暂性质可能需要连续给药，并且纳米颗粒被肝脏清除，这可能限制其生物利用度。基于慢病毒载体的方法由于潜在的转基因整合到旁观细胞（如生殖细胞、恶性细胞或抑制性免疫细胞）中的安全性问题，使得其体内应用更具挑战性，除非开发出更安全的靶向整合策略。非整合载体如AAV也在靶标细胞上表现出CAR表达的短暂性，这一特点可以平衡治疗疗效与安全性考虑，既有限制也有潜在优势。此外，载体组分可能引发免疫反应，导致纳米颗粒、病毒载体或由此产生的CAR工程细胞的清除，从而需要再次给药，这可能也会增加不良反应的风险。与体外自体CAR-T疗法相比，体内方法可能大大减少与细胞分离、基因修改和扩增相关的延迟，从而允许更快地开始治疗。然而，体内生成的CAR-T细胞在给药后仍需要时间来扩增，因此临床影响可能不是立即显现的。异体CAR-T细胞提供了一个中间解决方案，消除了患者特异性制造的需求，同时提供现成可用的产品，尽管免疫排斥和GvHD仍然是问题。在可扩展性方面，体内工程可能是最具成本效益和可扩展的方法，而异体CAR-T细胞与自体疗法相比减少了生产时间。此外，在体内CAR治疗的临床试验中必须考虑伦理影响，确保透明度和获得知情同意对于充分传达体内CAR治疗的潜在风险、益处和不确定性至关重要。在这种情况下，适应性试验设计将允许迭代改进安全性、疗效和可行性评估，以供更广泛的临床使用。在体内CAR工程的各种方法中，LNP-mRNA基础的CARs有首先达到临床的可能性。它们的短暂性质可能是长期CAR表达的限制，但有利于减轻毒性和允许在不冒基因组整合风险的情况下进行再给药。相比之下，慢病毒载体由于对插入突变和非靶标整合的担忧，面临重大障碍，除非开发出更安全的靶向整合策略，否则其体内应用将更具挑战性。

出现的技术如Cas9-EDVs提供了潜在的解决方案，通过实现精确的基因组编辑与持久的CAR表达，同时避免随机整合的风险。如果针对特异性、递送和免疫逃逸进行了优化，Cas9-EDVs可能代表体内CAR工程的未来。任何平台的临床成功都将取决于克服免疫反应、实现有效的体内靶向和展示比现有自体CAR-T细胞疗法更优越的安全性。同时，体外CAR工程的技术创新以及对免疫学的不断深入了解可以为体内CAR工程的进步提供助力。实现这些改进的策略包括：通过优化具有增强的细胞内信号域的CAR构建体进行基因修改；通过使用BET抑制剂或组蛋白去乙酰化酶抑制剂等表观遗传修改来维持较少分化的状态；通过结合IL-7、IL-

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