mRNA疗法在疫苗开发、基因治疗和再生医学等领域展现出巨大潜力。然而，LNP-mRNA在体内递送过程中面临诸多挑战，包括MPS的快速清除、非特异性摄取以及肝脏的优先摄取等。为了克服这些障碍，研究者们开发了多种策略，包括表面修饰、靶向配体共轭和聚乙二醇化等。最近，宾夕法尼亚大学Hamideh Parhiz 等研究人员开发了一种新型策略，并以“CD47 peptide-cloaked lipid nanoparticles promote cell-specific mRNA delivery” 发表在在Molecular Therapy。CD47作为一种广泛表达的“别吃我”信号分子，能够通过与信号调节蛋白α（SIRPα）相互作用抑制吞噬作用。本研究探讨了CD47肽修饰的脂质纳米颗粒（CD47/LNP）在细胞特异性mRNA递送中的应用。通过将CD47“别吃我”信号整合到LNP表面，结合先前建立的抗体靶向LNP（tLNP）技术，成功构建了CD47/tLNP平台，该平台能够减少单核吞噬细胞系统（MPS）的吞噬清除和脱靶效应，增强了LNP在血液中的循环时间，并提高了对内皮细胞、T细胞和造血干细胞（HSCs）的靶向递送效率。

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实验结果

在体外实验中，我们评估了CD47肽修饰对RAW 264.7巨噬细胞摄取LNP-mRNA的影响。通过流式细胞术和荧光显微镜观察，我们发现与未修饰的LNP-mRNA相比，CD47/LNP-mRNA处理组的细胞内绿色荧光蛋白（GFP）表达显著降低（P < 0.001）。具体而言，未修饰LNP-mRNA处理组的GFP平均荧光强度（MFI）为24,841相对荧光单位（RFU），而CD47/LNP-mRNA处理组的MFI显著降低至6,419 RFU。当使用SIRPα阻断抗体预处理细胞后，CD47/LNP-mRNA处理组的GFP表达部分恢复，MFI增加至13,032 RFU，表明CD47肽主要通过与SIRPα的相互作用来抑制巨噬细胞对LNP的摄取。

体内实验进一步证实了CD47修饰对LNP-mRNA体内分布的影响。通过放射性标记技术，我们发现CD47/LNP-mRNA在血液中的保留率显著高于未修饰的LNP-mRNA。具体而言，在注射后4小时，CD47/LNP-mRNA处理组小鼠血液中的放射性标记保留率约为20%注射剂量/克（ID/g），而未修饰LNP-mRNA处理组仅为约4% ID/g。此外，CD47/LNP-mRNA处理组小鼠肝脏和脾脏的放射性标记摄取量分别降低了约6倍和3倍（P < 0.01），表明CD47修饰显著减少了MPS对LNP的摄取。

Figure 1. CD47/LNP-mRNA evades macrophage recognition in vitro and liver uptake in vivo

为了评估CD47修饰对LNP-mRNA细胞特异性递送的影响，我们首先将抗CD31抗体共轭到CD47/LNP-Luc表面，用于靶向肺内皮细胞。通过生物发光成像技术，我们发现CD47+aCD31/tLNP-Luc处理组小鼠肺部的荧光素酶活性显著高于未修饰的aCD31/tLNP-Luc处理组（P < 0.01），同时肝脏和脾脏的荧光素酶活性显著降低。进一步通过流式细胞术分析，我们发现CD47+aCD31/tLNP-ZsGreen处理组小鼠肺内皮细胞中ZsGreen阳性细胞比例显著高于未修饰组（17.0% vs. 8.3%，P < 0.01），表明CD47修饰显著增强了LNP对内皮细胞的靶向递送效率。

类似地，我们将抗CD4抗体共轭到CD47/LNP-Luc表面，用于靶向T细胞。实验结果显示，CD47+aCD4/tLNP-Luc处理组小鼠脾脏中的荧光素酶活性显著高于未修饰的aCD4/tLNP-Luc处理组（P < 0.01），而肝脏中的荧光素酶活性显著降低。通过流式细胞术分析脾脏T细胞中的ZsGreen表达，我们发现CD47+aCD4/tLNP-ZsGreen处理组小鼠脾脏T细胞中ZsGreen阳性细胞比例显著高于未修饰组（51.1% vs. 46.6%，P < 0.05），表明CD47修饰也显著增强了LNP对T细胞的靶向递送效率。

Figure 2. CD47 modification enhances endothelial and T cell-targeting efficiency

为了评估CD47修饰在HSCs靶向递送中的应用潜力，我们将抗CD117抗体共轭到CD47/LNP-Puma mRNA表面，用于诱导HSCs凋亡。实验结果显示，与未修饰的aCD117/tLNP-Puma相比，CD47+aCD117/tLNP-Puma处理组小鼠骨髓中的荧光素酶活性显著增加（P < 0.01），而肝脏中的荧光素酶活性显著降低。进一步通过流式细胞术分析骨髓中的HSCs，我们发现CD47+aCD117/tLNP-Cre处理组小鼠骨髓HSCs中ZsGreen阳性细胞比例显著高于未修饰组（22.2% vs. 6.9%，P < 0.001），表明CD47修饰显著增强了LNP对HSCs的靶向递送效率。此外，CD47+aCD117/tLNP-Puma处理组小鼠在骨髓移植前的存活率显著高于未修饰组（100% vs. 35%，P < 0.01），表明CD47修饰通过减少肝脏毒性提高了HSCs耗竭疗法的安全性。

Figure 3. CD47 modification combined with aCD117/tLNP containing Puma mRNA reduces off-target Puma-induced toxicity and enables bone marrow transplantation (BMT)

为了评估CD47修饰对LNP-mRNA诱导的炎症反应的影响，我们检测了处理组小鼠外周血单个核细胞（PBMC）计数和血清中白细胞介素-6（IL-6）水平。实验结果显示，与未修饰的LNP-mRNA处理组相比，CD47/LNP-mRNA处理组小鼠的PBMC计数显著降低（P < 0.05），且血清中IL-6水平也显著降低（P < 0.05）。此外，在脂多糖（LPS）诱导的炎症模型中，CD47/LNP-mRNA处理组小鼠的血清IL-6水平也显著低于未修饰组（P < 0.05），表明CD47修饰显著降低了LNP-mRNA诱导的炎症反应。

为了探究CD47修饰对LNP蛋白冠组成的影响，我们通过尺寸排阻色谱和LC-MS技术分析了LNP在血清中形成的蛋白冠组成。实验结果显示，与未修饰的LNP相比，CD47/LNP的蛋白冠中载脂蛋白E（ApoE）的丰度显著降低（Z score = -0.04 vs. 1.02），而血清白蛋白（Albu）的丰度显著增加（Z score = 1.11 vs. -0.28）。这些变化可能与CD47/LNP在体内的长循环特性和减少的肝脏摄取有关。

Figure 4. Effect of CD47 modification on total liver transcriptome and protein corona composition