mRNA疫苗通过脂质纳米颗粒（LNP）递送系统，在体内实现高效的蛋白表达和免疫应答。然而，LNP本身也具有一定的免疫刺激性，其机制尚不完全清楚。最近，美国国防医科大学Allison M. W. Malloy等人在npj vaccines发表题为“Ionizable lipid nanoparticles of mRNA vaccines elicit NF-κB and IRF responses through toll-like receptor 4”的研究。本研究旨在揭示可电离脂质纳米颗粒在mRNA疫苗中如何通过TLR4激活NF-κB和IRF转录因子，从而调控先天免疫反应。通过使用人类单核细胞系（THP-1）和基因敲除细胞系，研究发现可电离脂质是LNP激活先天免疫细胞的主要因素，且这一过程主要通过TLR4/MyD88途径进行。研究结果为优化mRNA疫苗的设计提供了理论依据。

实验结果

本研究使用三种不同配方的可电离脂质纳米颗粒（LNP-1, LNP-ALC315, LNP-SM102）处理人类单核细胞系（THP-1），通过碱性磷酸酶报告基因检测NF-κB活性，荧光素酶报告基因检测IRF活性。结果显示，三种LNP均能显著激活THP-1细胞中的NF-κB和IRF转录因子（图1A, 2A）。具体而言，LNP-1在48小时时NF-κB活性达到峰值，约为未处理对照组的6-7倍；LNP-ALC315和LNP-SM102的NF-κB活性在48小时时也显著增加，分别约为对照组的4倍和3倍（图1A）。对于IRF活性，三种LNP均在48小时和72小时时表现出显著激活，其中LNP-SM102在72小时时IRF活性最高，约为对照组的1.7倍（图2A）。

为了验证可电离脂质在LNP激活NF-κB和IRF中的作用，本研究制备了不含可电离脂质的LNP（LNP-no ionizable lipid）。结果显示，去除可电离脂质成分后，LNP无法激活NF-κB和IRF转录因子（图1C, 2C）。这一结果表明，可电离脂质是LNP激活NF-κB和IRF的主要因素。

Fig. 1 | NF-κB signaling transduction in THP-1 reporter cell line.

Fig. 2 | IRF signaling transduction in THP-1 reporter cell line.

为了全面了解LNP处理后THP-1细胞的基因表达变化，本研究进行了RNA测序分析。结果显示，LNP处理后THP-1细胞中有大量基因表达发生变化，包括NF-κB和IRF信号通路的上调（图3A）。具体而言，与NF-κB和IRF相关的多个基因（如NFKB1, NFKB2, RELB, IRF3, IRF4, IRF7, IRF9等）均显著上调（图3B）。

为了进一步探究LNP处理后THP-1细胞中基因表达变化的生物学意义，本研究进行了基因集富集分析（GSEA）。结果显示，TLR信号通路在LNP处理后的THP-1细胞中显著上调（图3C, D）。这表明LNP通过激活TLR信号通路来调控NF-κB和IRF的活性。

Fig. 3 | THP-1 transcriptional response to LNP-1

为了验证LNP处理后THP-1细胞的活化状态，本研究使用流式细胞术分析了细胞表面标志物（如CD14, CD40, CD86）的表达变化。结果显示，LNP处理后THP-1细胞表面标志物CD14、CD40和CD86的表达均显著上调（图3E）。这表明LNP处理后THP-1细胞处于活化状态，进一步支持了LNP通过TLR4激活NF-κB和IRF的结论。

为了进一步探究LNP激活NF-κB和IRF的机制，本研究使用了TLR4基因敲除的THP-1细胞系。结果显示，在TLR4基因敲除的细胞中，三种LNP诱导的NF-κB和IRF反应均显著降低，但并未完全消失（图4A）。这表明TLR4是LNP激活NF-κB和IRF的主要受体，但可能还有其他途径参与。

为了进一步明确TLR4信号通路中的关键分子，本研究分析了MyD88和TRIF在LNP激活NF-κB和IRF中的作用。结果显示，在MyD88缺陷的THP-1细胞中，所有LNP诱导的NF-κB和IRF激活均显著降低（图4B）。而在TRIF缺陷的THP-1细胞中，不同LNP诱导的反应有所不同，但总体上IRF反应有所降低（图4B）。这表明LNP主要通过TLR4/MyD88途径激活免疫细胞，但对TRIF的依赖程度因LNP不同而有所差异。

Fig. 4 | LNP-mediated NF-ĸB and IRF signaling transduction dependence on TLR4 and adaptor molecules.

研究进一步观测了LNP和mRNA-LNP在野生型和TLR4敲除细胞系中诱导的NF-κB和IRF反应。除了报告基因检测外，还通过流式细胞术分析了细胞表面标志物CD86的表达变化，以评估细胞的活化状态。验证了mRNA的加入并未显著增强LNP的激活作用，即LNP本身是主要的免疫刺激性成分。进一步确认了TLR4在LNP（包括mRNA-LNP）激活NF-κB和IRF反应中的关键作用。

Fig. 5 | Response to LNPs compared to mRNA-LNP in THP-1.

讨论

本研究表明，可电离脂质纳米颗粒在mRNA疫苗中通过TLR4激活NF-κB和IRF转录因子，从而调控先天免疫反应。这一发现为优化mRNA疫苗的设计提供了重要理论依据。通过调整LNP的脂质组成，可以平衡疫苗的耐受性和刺激强度，从而开发出更安全、更有效、更持久的mRNA疫苗。此外，本研究还揭示了LNP激活先天免疫细胞的复杂机制，为未来的研究提供了新的方向。