囊性纤维化（CF）是一种由囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）基因突变引起的常染色体隐性遗传病，全球约有70,000人受影响。CFTR基因突变导致氯离子跨上皮细胞顶膜运输失调，进而引发多器官功能障碍，尤其是肺部功能受损。目前，尽管已有多种治疗CF的方法，但基因编辑技术如CRISPR/Cas9系统为从根本上纠正CFTR基因突变提供了新途径。然而，如何高效、精准地将CRISPR/Cas9组件递送至靶细胞仍是主要障碍。脂质纳米颗粒（LNPs）作为一种临床认可的核酸递送系统，因其模块化和临床应用潜力而备受关注。LNPs可递送CRISPR/Cas9组件，无论是作为Cas9 mRNA还是Cas9蛋白复合物（RNP）。近日，Michael J. Mitchell课题组在Nano letters上发表名为“Cas9 Protein Outperforms mRNA in Lipid Nanoparticle-Mediated CFTR Repair”的研究。本研究旨在比较LNPs递送Cas9蛋白与mRNA在CF相关临床靶点中的编辑效率和功能恢复效果，以优化CRISPR/Cas9 LNPs在CF治疗中的应用。

示意图

01
实验结果

在H1299细胞（表达GFP的肺癌细胞系）中，研究评估了Cas9蛋白与mRNA LNPs在CRISPR/Cas9编辑中的效率。实验结果显示，在NHEJ（非同源末端连接）编辑效率上，蛋白LNPs显著优于mRNA LNPs。具体而言，所有五种蛋白LNPs均能显著降低GFP阳性细胞比例，而mRNA LNPs中仅有C12-200表现出类似效果（图1）

Figure 1. LNP encapsulation of Cas9 mRNA and protein achieves corrective editing in lung cancer cell lines.

通过静脉注射将含有DiR荧光染料的LNPs（包括五种可离子化脂质结构，每种结构分别封装Cas9 mRNA或蛋白）注入小鼠体内，6小时后通过IVIS荧光成像系统观察LNPs在体内的分布情况。实验结果显示，所有LNPs均表现出一定程度的肺趋向性，其中C12-497和C14-488 LNPs在肺部的荧光强度最高（图2B和2C）。具体而言，C12-497蛋白LNPs和mRNA LNPs在肺部的荧光比例分别达到52.9%和49.0%，而C14-488蛋白LNPs和mRNA LNPs则分别达到45.6%和49.4%。

尽管mRNA LNPs在绝对荧光效率上略高于蛋白LNPs（图2D），但两者在肺部的分布比例并无显著差异（图2E）。这表明，无论是封装Cas9 mRNA还是蛋白，LNPs均能有效靶向肺部，但mRNA LNPs可能在其他器官（如肝脏）的分布上略占优势。进一步分析发现，不同可离子化脂质结构对LNPs的肺趋向性影响显著。例如，C12-200（一种已知的肝靶向金标准脂质）在肺部的荧光强度显著低于其他四种脂质结构，这进一步证实了脂质成分在器官靶向性中的关键作用。

Figure 2. LNPs incorporate Cas9 protein and mRNA and exhibit lung tropism.

为在Ai9小鼠模型（含有LoxP-STOP-LoxP-tdTomato盒的转基因小鼠）中，研究评估了Cas9蛋白与mRNA LNPs在肺部的敲除编辑效率。实验结果显示，蛋白LNPs在肺部的tdTomato荧光强度显著高于mRNA LNPs（图3B）。具体而言，有效蛋白LNP处理的细胞tdTomato阳性率达到6.8%，而有效mRNA LNP处理的细胞仅为1.14%（图3C和3D）。这表明，蛋白LNPs在体内具有更强的敲除编辑能力。进一步分析发现，蛋白LNPs在肺部的编辑效率与其在细胞实验中的表现一致，这进一步证实了蛋白LNPs在CRISPR/Cas9编辑中的优势。

Figure 3. Functional editing associated with LNP delivery of Cas9 and sgRNA targeted for the Ai9 cassette.

为了评估Cas9蛋白与mRNA LNPs在恢复CFTR蛋白功能方面的效果，研究在F508del 16HBEge细胞（携带F508del CFTR突变的支气管上皮细胞系）中进行了氯离子通量实验。实验结果显示，用C14-488蛋白LNPs处理的细胞中氯离子通量显著高于用mRNA LNPs处理的细胞，接近野生型16HBE细胞水平（图4H）。这表明，蛋白LNPs在恢复CFTR蛋白功能方面更具优势。进一步在16HBEge细胞中评估HDR编辑效率时发现，蛋白LNPs显著优于mRNA LNPs。具体而言，C12-497和C14-488蛋白LNPs在10 ng和20 ng sgRNA剂量下均表现出较高的HDR编辑效率（图4F和4G），而mRNA LNPs在所有剂量下均未检测到显著的HDR编辑。

分析发现，蛋白LNPs的优势可能归因于其RNP（核糖核蛋白）复合物的同时转运能力更强，且不需要核糖体翻译过程，从而避免了mRNA递送中可能出现的Cas9与sgRNA解离问题。此外，蛋白LNPs的短暂性特性也减少了脱靶效应，提高了编辑的精准度。

Figure 4. LNP characterization and CRISPR/Cas9 editing of CF cells.

02
结论

本实验结果明确表明，在CFTR基因编辑和功能恢复方面，LNPs递送Cas9蛋白显著优于递送Cas9 mRNA。这一发现为优化CRISPR/Cas9 LNPs在CF治疗中的应用提供了重要依据。未来研究应深入探讨Cas9蛋白在细胞内的作用机制，并进一步优化蛋白LNPs的递送系统，以提高其在临床应用中的有效性和安全性。