单细胞RNA测序鉴定ECM产生细胞：通过对DOCA/盐诱导的高血压肾病小鼠模型的肾脏进行单细胞RNA测序（scRNA-seq），研究成功鉴定了肾脏中主要的ECM产生细胞类型，包括成纤维细胞、周细胞和肌成纤维细胞。
这些细胞类型在二维t-SNE图中清晰区分，共形成23个不同的细胞簇（图1A）。通过分析各细胞簇的ECM成分基因表达分数，研究发现成纤维细胞、周细胞和肌成纤维细胞是ECM产生的主要细胞类型（图1C, D）。特别是成纤维细胞，在高血压条件下表现出最高的ECM产生能力（图1C）。
进一步分析这些ECM产生细胞类型的差异表达基因（DEGs），研究筛选出30个特异性高表达的基因，其中9个编码候选表面抗原。在这些候选抗原中，PDGFRβ在ECM产生细胞中的表达特异性和水平均高于其他候选抗原，特别是在肌成纤维细胞中（图1E, F）。免疫荧光染色证实，PDGFRβ在PDGFRα+成纤维细胞、NG2+周细胞和α-SMA+肌成纤维细胞中均有高表达（图1G）。因此，PDGFRβ被选为抗纤维化CAR-T疗法的潜在靶点。
Figure 1. PDGFRβ is a potential targeting surface antigen for anti-fibrotic CAR-T against CKD
PDGFRβ CAR-T细胞显著减轻多种CKD小鼠模型的纤维化相关病理
PDGFRβ CAR-T细胞的构建与验证：研究设计并构建了针对PDGFRβ的第二代CAR，包括scFv抗-PDGFRβ、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号结构域。通过慢病毒转导，成功将CAR基因导入小鼠脾脏来源的T细胞中，生成PDGFRβ CAR-T细胞。流式细胞术分析显示，约50%-80%的T细胞表达GFP和mPDGFRβ CAR（图2A, B）。与对照载体转导的T细胞（Vec-T）相比，mPDGFRβ CAR-T细胞对小鼠肾间质成纤维细胞表现出更强的细胞毒性（图2C）。
PDGFRβ CAR-T细胞在CKD早期阶段的保护作用
在DOCA/盐诱导的高血压肾病模型中，研究在建模后1周（早期阶段）和4周（发展阶段）分别注射mPDGFRβ CAR-T细胞。结果显示，早期阶段注射mPDGFRβ CAR-T细胞显著恢复了肾小球滤过率（GFR），降低了尿白蛋白/肌酐比值（UACR）、血清肌酐（SCr）和血尿素氮（BUN）水平，同时降低了血压（图2E-H）。此外，mPDGFRβ CAR-T细胞还显著减轻了肾脏纤维化程度（图2I）。与发展阶段相比，早期阶段注射mPDGFRβ CAR-T细胞显示出更好的保护作用（图2E-I）。
PDGFRβ CAR-T细胞在其他CKD模型中的效果
为了验证PDGFRβ CAR-T细胞的广泛适用性，研究在Ang II诱导的高血压模型、STZ/高脂饮食诱导的糖尿病肾病模型和UUO模型中进行了进一步评估。结果显示，mPDGFRβ CAR-T细胞在这些模型中同样显著减轻了肾脏纤维化程度，并改善了肾功能。值得注意的是，与mFAP CAR-T细胞相比，mPDGFRβ CAR-T细胞对心肌间质纤维化和血管周围纤维化的抑制效果更优（图2J）。
Figure 2. PDGFRβ CAR-T therapy protects against fibrosis-associated pathologies in hypertensive mice
PDGFRβ CAR-T细胞减少ECM产生细胞并恢复肾功能
scRNA-seq分析CAR-T细胞治疗后的肾脏细胞组成：为了深入了解PDGFRβ CAR-T疗法改善肾脏损伤的机制，研究对CAR-T细胞治疗后的高血压小鼠肾脏进行了scRNA-seq分析。结果显示，mPDGFRβ CAR-T细胞输注减少了成纤维细胞、周细胞和肌成纤维细胞的比例，同时增加了实质细胞的比例（图3A）。免疫荧光染色进一步证实了肾脏中ECM产生细胞的减少（图3B）。
DEGs和通路富集分析：通过差异基因表达分析，研究获得了mPDGFRβ CAR-T细胞治疗后的高血压小鼠肾脏中516个DEGs，其中180个上调，336个下调。Metascape通路富集分析显示，下调基因主要富集在ECM相关通路，而上调基因主要富集在肾小管重吸收和代谢通路（图3C）。这表明PDGFRβ CAR-T疗法在影响ECM产生的同时，还恢复了肾脏功能。免疫荧光染色显示，PDGFRβ CAR-T疗法减少了肾小管间质中胶原I和波形蛋白的积累，恢复了近端小管刷状缘的面积（图3D, E）。
细胞间相互作用分析：通过细胞间相互作用分析，研究发现成纤维细胞簇与其他细胞簇的相互作用最强，特别是与足细胞的相互作用（图3F, G）。这表明PDGFRβ CAR-T疗法可能通过减少ECM产生细胞与足细胞的相互作用，从而对肾小球硬化和足细胞损伤产生保护作用。
Figure 3. mPDGFRβ CAR-T cells reduce ECM-producing cells and restore renal function in hypertensive mice
体内生成的PDGFRβ CAR-T细胞有效治疗CKD
CD5/LNP介导的体内CAR-T细胞生成：为了简化CAR-T细胞的制备流程并降低成本，研究开发了基于CD5抗体修饰的脂质纳米颗粒（LNP）包裹PDGFRβ CAR-mRNA的体内CAR-T细胞生成系统。体外实验显示，CD5/LNP-PDGFRβ CAR-mRNA转导的T细胞高效表达mPDGFRβ CAR，并对小鼠肾间质成纤维细胞表现出强细胞毒性（图4A, B）。
体内CAR-T细胞生成系统的抗纤维化效果在DOCA/盐诱导的高血压肾病模型中，研究通过静脉注射CD5/LNP-PDGFRβ CAR-mRNA生成CAR-T细胞。结果显示，注射后2天，脾脏T细胞中约6%表达GFP和CAR（图4C）。这些体内生成的CAR-T细胞显著减轻了UACR、肾脏、心肌和血管周围纤维化程度（图4D-H）。
Figure 4. PDGFRβ CAR-T cells produced in vivo ameliorate fibrosis-associated pathologies in hypertensive mice
hPDGFRβ CAR-T细胞减轻人多能干细胞来源的肾脏类器官纤维化
hPDGFRβ CAR-T细胞的构建与验证：为了评估PDGFRβ CAR-T疗法在人类中的潜在应用，研究构建了针对人PDGFRβ的CAR-T细胞。通过杂交瘤技术生成抗hPDGFRβ scFv，并将其与人CD8α、4-1BB和CD3ζ结构域融合，构建第二代CAR。转导人T细胞后，约80%的T细胞表达GFP（图5A）。与对照细胞相比，hPDGFRβ CAR-T细胞对表达hPDGFRβ的HEK293T细胞表现出强细胞毒性（图5B）。
hPDGFRβ CAR-T细胞在肾脏类器官中的抗纤维化效果：研究利用人多能干细胞来源的肾脏类器官模拟CKD的纤维化过程。通过反复顺铂处理触发肾小管间质纤维化后，将hPDGFRβ CAR-T细胞显微注射到类器官中。结果显示，hPDGFRβ CAR-T细胞显著减少了类器官中的胶原沉积（图5E），并改善了肾小管上皮细胞和足细胞的损伤（图5F）。此外，hPDGFRβ CAR-T细胞未对正常肾脏类器官细胞产生脱靶毒性（图5E, F）。
Figure 5. hPDGFRβ CAR-T cells reduce tubulointerstitial fibrosis in kidney organoid CKD model
