迈安纳

本研究针对椎间盘退行性变（IVDD）这一慢性退行性疾病，提出通过调控髓核祖细胞（NPPCs）的再生能力来逆转IVDD的策略。针对衰老NPPCs再生潜力下降的问题，研究设计了一种靶向NPPCs的脂质胸腺嘧啶纳米颗粒（NT-LNP），用于递送Klotho环状RNA（circRNA），以恢复NPPCs的再生修复潜力并减轻IVDD。

体内外实验结果表明，NT-LNP能有效将Klotho circRNA导入NPPCs，促进其年轻化表型并调节细胞外基质（ECM）的合成/分解平衡。同时，结合可注射水凝胶系统，通过清除炎症趋化因子（MCP1和IL8），调控炎症环境，协同促进退变椎间盘的再生。本研究为IVDD及其他衰老相关疾病提供了可逆的治疗策略。

文中LNP制备使用了迈安纳（上海）仪器科技有限公司的微流控设备进行制备。

迈安纳微流控XNano系列设备及试剂盒

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01 实验结果

Klotho基因在IVDD中的表达下调与衰老阶段相关

1.1

单细胞RNA测序分析

通过scRNA-seq技术，我们成功识别了人类椎间盘组织中的六个细胞簇，包括效应NP细胞（EﬀectorNP）、稳态NP细胞（HomNP）、肥大NP细胞（HTNP）、髓核祖细胞（NPPCs）以及两种祖细胞群（CD24+/MKI67+ progenitors）。分析显示，随着IVDD分级增加，NPPCs的比例逐渐下降（图1d）。这一发现表明，NP细胞分化能力在退变椎间盘中减弱。

进一步分析发现，衰老相关标志物ADAMTS5在HTNP群体中表达，但在NPPCs中不表达，这表明NPPCs具有良好的再生和分化潜力（图1e,f）。此外，年轻NPPCs高度表达α-Klotho，而随着衰老阶段增加，其表达逐渐下降（图1g-j）。

图 1. 该发现突显了克洛索基因在椎间盘退变中的关键作用。

1.2

MRI与组织学分析

MRI成像结合蛋白分析显示，IVDD患者的椎间盘组织中，Klotho表达水平随衰老程度增加而显著降低。年轻患者的椎间盘组织中Klotho表达较高，而老年患者则显著降低，这与scRNA-seq结果一致。

NT-LNP的制备与表征

2.1

纳米颗粒的物理化学性质

使用微流控系统制备的NT-LNP具有均匀的粒径分布，平均粒径约为100nm（图2c）。Zeta电位接近零，表明纳米颗粒具有良好的胶体稳定性（图2d）。

TEM观察显示，LNP呈清晰的球形形态，表面光滑（图2e）。此外，LNP在7天内保持相对稳定的粒径，表明其具有良好的稳定性（图2g）。

2.2

RNA完整性保护

Sanger测序验证了circRNA样本的连接位点，确认了α-Klotho-circRNA的形成（图S4）。RNA片段完整性实验表明，LNP能有效保护circRNA免受核糖核酸酶（RNase）的降解（图2f）。

图 2. LNP-GAG 凝胶给药系统的特性分析。

NT-LNP在体外有效转染NPPCs并上调Klotho基因表达

3.1

转染效率评估

共聚焦显微镜分析显示，Vas修饰的LNP（NT-LNP）显著提高了NPPCs对Klotho circRNA的摄取效率（图3a）。流式细胞术进一步证实，NT-LNP组NPPCs的转染效率显著高于非修饰LNP组（KLNP组）（图3b,c）。

长时间孵育后，Cy5标记的Klotho circRNA在NPPCs内广泛分布，表明LNP成功从溶酶体逃逸并进入细胞质（图3e）。

3.2

基因表达变化

RT-PCR分析显示，NT-KLNP转染的NPPCs中，与ECM合成相关的基因（如SOX9和ACAN）显著上调，而与ECM分解相关的基因（如MMP10和MMP13）显著下调（图3f）。这表明NT-KLNP能有效调节NPPCs的ECM代谢平衡。

KEGG通路分析显示，NT-KLNP上调了与细胞年轻化相关的通路（如oxytocin、cAMP、apelin、胰岛素分泌和Wnt信号通路），同时下调了与炎症和衰老相关的通路（如IL17信号通路、TRP通道介导的炎症调节、钙信号通路等）（图3g）。

图 3. NT-KLNP 的转染效率及体外 GAG 凝胶性能评估。

NT-KLNP@GAG水凝胶在体内促进椎间盘再生

4.1

水凝胶的制备与表征

制备的GAG基水凝胶具有良好的微观结构，TEM和SEM观察显示其具有多孔网络结构（图2h,i）。模量分析显示，G'值显著高于G''值，表明水凝胶成功形成（图2j）。化学趋化因子结合实验表明，GAG水凝胶能有效结合MCP1和IL8，且结合能力受硫酸化模式和浓度影响。

4.2

体内降解与生物相容性

体内降解实验显示，NT-KLNP溶液在6天内迅速降解，而NT-KLNP@GAG水凝胶则显著减缓了降解速率，15天后仍有约23%的残留（图4b-e）。

图 4. NT-KLNP@GAG 凝胶递送系统对椎间盘修复效果的体内评估。

生物相容性实验表明，GAG水凝胶对NPPCs的细胞活力无显著影响，且未引起体内重要器官的显著损伤（图3k,l）。

4.3

椎间盘再生效果

X射线与MRI成像显示，NT-KLNP@GAG水凝胶治疗组的椎间盘高度和水合状态显著优于其他组（图5a-i）。组织学染色进一步证实，NT-KLNP@GAG水凝胶治疗组的椎间盘结构更完整，ACAN表达水平更高（图4f-j; 图5m）。

炎症因子基因表达分析显示，NT-KLNP@GAG水凝胶显著降低了椎间盘组织中的MCP1、IL1β和TNFα表达水平（图5j-l）。

图 5. NT-KLNP@GAG 凝胶递送系统对椎间盘修复效果的体内评估。

NT-KLNP通过激活SIRT6/NRF2/HO-1通路保护NPPCs免受衰老影响

5.1

蛋白表达分析

Western blot分析显示，NT-KLNP显著上调了NPPCs中SIRT6和NRF2的表达水平，形成了SIRT6/NRF2/HO-1蛋白复合物（图6b-f）。该复合物通过结合抗氧化反应元件（AREs），激活了抗氧化基因（如HO-1）的转录。

5.2

线粒体功能保护

JC1检测显示，NT-KLNP有效减轻了NPPCs的线粒体氧化应激，表现为JC1聚集体增加和单体减少（图6g-j）。这表明NT-KLNP通过激活SIRT6/NRF2/HO-1通路，保护了NPPCs的线粒体功能。

图 6. NT-KLNP 通过 SIRT6/NRF2/HO-1 轴诱导 NPPC 细胞年轻化。

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02 结论

本研究通过设计靶向NPPCs的NT-LNP，成功递送了Klotho circRNA，恢复了NPPCs的再生能力，并促进了椎间盘的再生。结合可注射水凝胶系统，通过清除炎症趋化因子，调控了炎症环境，进一步协同促进了椎间盘的再生。本研究不仅为IVDD的治疗提供了新的策略，也为其他衰老相关疾病的治疗提供了可借鉴的方法。通过调控NPPCs的再生能力，可以逆转IVDD的进程。NT-LNP结合可注射水凝胶系统为IVDD的治疗提供了一种有效的策略，具有广泛的应用前景。未来的研究将进一步优化该系统，并探索其在临床转化中的潜力。

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