从mRNA递送到T细胞激活：新型纳米载体实现CAR-T体内原位生成

文献分享｜ERTLNPs将mRNA递送与T细胞激活整合于同一纳米载体

研究以对甲苯磺酰精氨酸（RT）修饰的低聚乙烯亚胺（OEI-RT）为可电离聚合物，与DSPC、DMG-PEG及胆固醇共组装形成ERTLNPs。OEI-RT是实现有效mRNA转染的关键组分；去除该组分后，静脉给药所产生的功能性表达几乎可以忽略。不同氨基酸及对甲苯磺酰基修饰聚合物的比较显示，OEI-RT对应的ERTLNPs具有更强的脾脏功能性表达，说明该效果依赖精细的聚合物结构，而非简单增加正电荷即可获得。

配方筛选发现，DMG-PEG质量占比为20%时表现最佳：主要器官的生物发光信号中，脾脏占94.4%；作为对照，SM-102 LNP的表达则以肝脏为主。该配方粒径约180 nm，PDI低于0.3，mRNA包封效率高于85%。提高RT接枝密度也能增强体内转染，45%接枝组表现最优。

值得关注的是，标记颗粒和mRNA在肝、脾均有蓄积，而最终翻译产物主要集中于脾脏。这提示“颗粒进入哪个器官”并不等同于“mRNA在哪个器官有效表达”。蛋白质冠分析还发现多类免疫相关蛋白富集，可能参与载体与脾脏免疫细胞的相互作用。研究共检出1942种血浆吸附蛋白，其中146种在ERTLNPs蛋白质冠中显著富集；部分蛋白与免疫受体结合有关。这为其组织与细胞选择性提供了可能解释，但不能单凭蛋白质冠直接认定靶向机制。

研究向mTmG报告小鼠静脉注射负载Cre-mRNA的ERTLNPs。48小时后，脾脏T细胞转染比例达到8.04%，高于NK细胞（3.46%）、巨噬细胞（4.13%）、树突状细胞（3.97%）及B细胞（0.34%），其中CD8⁺ T细胞更易被转染。体外实验中，ERTLNPs对Jurkat细胞的转染率接近90%，对小鼠原代脾脏T细胞约为20%，对人外周血单个核细胞（PBMC）最高达50%。

这些结果说明，载体无需抗体或其他靶向配体修饰，即可实现一定程度的T细胞优先功能性转染，为体内CAR-T生成提供递送基础。需要注意，人PBMC是包含不同免疫细胞的混合细胞群，其整体转染比例并不等同于纯化人T细胞的转染率；从动物模型走向人源T细胞仍需进一步验证。

ERTLNPs与原代T细胞共孵育后，6小时即可观察到激活标志物CD69上调；24小时的激活水平与抗CD3/CD28刺激相当，并促进Ki-67表达、细胞增殖、细胞因子释放和脱颗粒。相比之下，MC3、SM-102及ALC-0315等常见LNP几乎不能有效激活T细胞。CD69升高可持续观察至48小时，96小时检测显示Ki-67相关增殖水平高于抗CD3/CD28刺激组。活化后的T细胞还出现IL-2、IFN-γ和TNF-α释放增加，提示该过程不仅改变表面标志物，也伴随效应功能增强。

更重要的是，ERTLNPs处理组的PD-1、TIM-3等耗竭相关标志物显著低于抗CD3/CD28刺激组；小鼠体内也观察到激活与增殖增强，而PD-1阳性T细胞比例未明显上升。研究还证明，无需先用磁珠预激活T细胞，直接共孵育ERTLNPs/mRNA即可实现一步法“激活+转染”。mTOR抑制会同时降低激活和转染效率，二者呈较强正相关（r=0.892）。

ERTLNPs并非单纯的mRNA运输工具，其结构还可直接激活T细胞。机制研究发现两条并行通路：首先，载体作用于T细胞膜表面IGF-1R，启动PI3K/AKT/mTOR信号；IGF-1R抑制剂可削弱CD69、CD107a上调及相关蛋白磷酸化。对CD3、CD4、CD8、CD28、TCR及多种Toll样受体进行阻断时，并未观察到与IGF-1R抑制相近的效果，支持其并非主要通过传统TCR信号完成激活。

其次，ERTLNPs主要经巨胞饮进入细胞，在溶酶体内由精氨酸感知蛋白TM4SF5识别。分子对接、等温滴定量热及TM4SF5敲低结果进一步支持OEI-RT与TM4SF5的相互作用。两条通路共同汇聚于mTOR，驱动T细胞激活、代谢重编程与后续转染，而不必依赖传统TCR持续刺激。

RNA-seq显示，ERTLNPs可广泛调节T细胞激活、糖酵解及PI3K/AKT/mTOR相关基因。功能实验进一步证实，处理后T细胞葡萄糖摄取、ATP水平及GLUT1、HIF-1α表达增加，提示细胞代谢转向支持活化与增殖的状态；抑制mTOR可逆转相关变化。ERTLNPs组有2597个基因上调、2964个下调，GO和KEGG分析富集于细胞增殖、蛋白磷酸化、糖酵解以及HIF-1等相关过程。

与抗CD3/CD28刺激相比，ERTLNPs未显著诱导Pdcd1、Ctla4、Lag3等耗竭相关转录程序，反而上调Ccr7、Tcf7等记忆T细胞相关基因。这为其“有效激活而较少出现耗竭表型”的观察提供了转录组层面的支持，但仍需更长期的功能研究验证。基因表达变化不能直接代表细胞在体内具有更持久的记忆功能或更好的长期疗效。

为验证治疗潜力，研究选用在活化成纤维细胞中高表达的成纤维细胞活化蛋白（FAP）作为靶点，向ERTLNPs装载编码FAP CAR的mRNA。体外培养24小时后，约25%的原代CD3⁺ T细胞表达FAP CAR；全身给药后，约8%的脾脏T细胞成为CAR阳性，而其他主要免疫细胞的CAR阳性率均低于2%。

由于采用非整合型mRNA，CAR表达呈瞬时变化：脾脏CAR阳性T细胞由第1天的7.7%降至第4天的3.9%。这一特性意味着维持疗效可能需要重复给药，但也可限制持续CAR表达。功能实验显示，这些CAR-T细胞可特异性杀伤FAP阳性靶细胞，并释放IL-2、TNF-α和IFN-γ；在特定效靶比下，杀伤表现与慢病毒制备的CAR-T相当。

在特发性肺纤维化患者公开数据及博来霉素诱导的小鼠模型中，研究均观察到纤维化组织FAP表达升高。体内生成的FAP CAR-T能够进入纤维化肺病灶，接近FAP阳性成纤维细胞，为靶向清除病理基质细胞提供依据。

治疗实验中，小鼠每3天静脉注射一次ERTLNPs/mFAP CAR，共4次，并设置吡非尼酮等对照。与相关对照组相比，治疗组体重维持较稳定，肺湿重及羟脯氨酸含量下降；FAP阳性成纤维细胞和巨噬细胞减少。组织染色显示胶原沉积降低、肺泡结构改善，同时TGF-β1、IL-4、IL-13等促纤维化因子下调。

在该动物模型与给药条件下，ERTLNPs/mFAP CAR在多项纤维化指标上表现出改善，且主要肝肾生化指标与健康对照相近。这些结果支持体内CAR-T用于抗纤维化治疗的可行性，但不能直接推断人体临床疗效。

研究在肝纤维化及原位胰腺癌模型中也观察到治疗获益。重复给药实验中，与抗CD3抗体对照相比，ERTLNPs未明显升高T细胞PD-1水平；急性给药后的炎症因子、主要器官组织学及人全血补体激活相关检测也未见显著异常。

需要强调，这些仅是研究条件下的初步安全性结果，尚不能替代长期重复给药、组织脱靶及系统毒理评价。急性炎症检测中，多项血清炎症因子没有明显升高；在人全血或血清实验中，IL-6、IL-2、TNF-α及C3a、Bb、sC5b-9等补体激活标志物亦未见明显诱导。

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