mRNA疫苗的核心是其序列设计。本研究中使用的mRNA序列包含5'非翻译区（UTR）、编码5种抗原的序列、GFP报告基因、3'UTR以及聚腺苷酸（PolyA）尾。5'和3'UTR序列对于mRNA的稳定性和翻译效率至关重要，通常来源于高表达基因的UTR区域，如α-珠蛋白基因。PolyA尾不仅促进有效翻译，还能增强mRNA的稳定性，可通过DNA模板编码或在体外转录后添加。此外，质粒中还设计了独特的限制酶位点，便于质粒DNA的线性化，为后续的体外转录（IVT）做准备。

质粒DNA的准备是mRNA合成的基础。通过细菌转化，使用STBL3大肠杆菌细胞放大编码mRNA模板的质粒DNA。这一过程包括将少量质粒DNA与细菌细胞混合、热激处理、培养以及筛选单个菌落进行扩增。最终，使用市售的无内毒素质粒DNA分离试剂（如Promega的PureYield Plasmid Maxiprep System）提取质粒DNA，以确保后续实验的顺利进行。

树突状细胞（DCs）是专业的抗原呈递细胞，在启动免疫反应中发挥关键作用。本研究中，通过从6-8周龄小鼠的骨髓中分离细胞，并在GM-CSF的作用下培养分化成BMDCs。这一过程需要精确的细胞操作和培养条件控制，以确保获得高质量的BMDCs，用于后续的体外实验。

B16F10黑色素瘤细胞系用于模拟肿瘤环境，评估疫苗的抗肿瘤效果。细胞在DMEM培养基中培养，至少在解冻后3-7天收集，以确保细胞从解冻过程中恢复，保持良好的生长状态。收集的细胞用于后续的体内移植实验，以评估疫苗的保护效果。

mRNA的合成是疫苗制备的关键步骤。使用线性化的DNA模板进行体外转录（IVT），并在反应中加入CleanCap AG和N1-甲基伪尿苷-5'-三磷酸（m1c），以减少mRNA的免疫原性并提高翻译效率。合成后的mRNA通过Agilent RNA 6000 Nano kit assay进行质量控制，确保mRNA的纯度和完整性。此外，通过dot-blot分析检测IVT RNA样本中的双链RNA（dsRNA）含量，因为dsRNA可能具有免疫原性，影响疫苗的安全性和有效性。

图 1 .mRNA 纯度和免疫原性的表征

为了评估mRNA的免疫原性，使用THP-1细胞系检测IVT mRNA封装在脂质体中的I型干扰素反应。这一检测不仅有助于评估mRNA本身的免疫原性，还能反映LNP封装对mRNA免疫原性的影响。通过量化细胞上清中的干扰素水平，可以筛选出免疫原性较低的mRNA构建体，为疫苗的安全性提供保障。

mRNA-LNP的制备是疫苗递送系统的关键环节。将mRNA封装在LNP中，以保护mRNA免受降解，并促进其通过内吞/吞噬途径进入细胞。本期文章将继续分享mRNA-LNP的制备流程，包括含、RNA的水相样品准备和微流控法包封mRNA-LNP。

LNP的脂质组分是影响其性能的关键因素之一。常用的LNP配方包括可电离脂质、磷脂DSPC、胆固醇和稳定剂，其摩尔比为50:10:37.5:2.5。这种配方经过优化，能够有效地保护mRNA，促进其在细胞内的释放，并减少免疫原性。

在实际应用中，根据不同的mRNA疫苗或药物的需求，脂质的摩尔比例和总浓度可能会有所调整。例如，BioNTech的BNT-162b2、Moderna的mRNA-1273以及Alnylam的Onpattro等获批用于人体的LNP配方，其脂质组分和摩尔比例各有特点，以适应不同的治疗目标和递送需求。

mRNA样品的浓度和氮磷比（N/P）是影响LNP包封效果的重要参数。N/P比是指脂质中的氮原子与mRNA中的磷原子的摩尔比，常用的N/P比为4、6或8。N/P比的计算公式为：

N/P=脂质含N摩尔数/mRNA含P摩尔数

磷（P）：每个碱基含有一个磷酸根，1 mol的核糖核苷酸包含1 mol的磷酸基团。RNA脱水聚合后的平均分子量均值为320.5 g/mol。

氮（N）：常规的四组分LNP脂质中，以可电离脂质比例计算氮原子数，每个可电离脂质包含1个氮原子（D-LIN-MC3、ALC-0315、SM-102）。以可电离脂质占比50%计算，每mol总脂质中包含0.5 mol的氮原子。注：部分脂质含有多个N原子，或多个组分含有N原子，计算时需注意。

在制备过程中，根据脂质摩尔浓度和N/P比，可以计算出所需的mRNA浓度。例如，当总脂质摩尔浓度为12mM，N/P比为6时，mRNA的浓度约为107 μg/mL。

mRNA-LNP的包封具体步骤如下：

料液准备：按照实验设计，配置水相（包含缓冲液和mRNA）和有机相（脂质混合物）。

注射器装载：将水相和有机相分别吸入注射器中，并排出空气。将装有mRNA溶液的注射器和装有脂质混合物的注射器插入芯片接口。

仪器设置：设置总流速（TFR）为12mL/min、总体积2mL、水相/有机相流速比（FRR）为3:1，初始排废体积为0.35mL，结束排废量为0.05 mL。

运行与收集：启动仪器，收集包封后的mRNA-LNP样品。

后处理：通过超滤或透析将mRNA-LNP换液至特定缓冲液，以去除有机溶剂。

制备后的mRNA-LNP通过动态光散射（DLS）和Quant-it Ribogreen测定法进行物理化学特性表征，评估其粒径、电位、封装效率和稳定性。这些参数对于确保疫苗的有效递送和释放至关重要。

图 2 .新鲜和冷冻 mRNA-LNPs 的理化及稳定性特性的测定

在B16F10癌细胞系和BMDCs中转染mRNA疫苗后，使用抗H2-Kb/SIINFEKL-PE偶联抗体检测SIINFEKL肽在H2-Kb上的呈递。这一实验步骤不仅验证了mRNA疫苗在细胞内的翻译和抗原呈递能力，还作为质量控制的关键环节，确保疫苗能够有效激活免疫系统。

在小鼠模型中，通过尾静脉注射mRNA-LNP疫苗进行免疫，评估其诱导的抗原特异性CD8+ T细胞反应。使用四聚体肽-MHC-I复合物（tetramers）检测抗原特异性T细胞，为疫苗的免疫原性提供直接证据。此外，通过肿瘤挑战模型评估疫苗的抗肿瘤效果，以肿瘤生长作为指标，进一步验证疫苗的实际应用潜力。

a. 通过腹腔注射 0.1ml 20% 氯胺酮、10% 戊巴比妥钠混合液（用蒸馏水稀释）使小鼠麻醉（假设小鼠体重为 25 克，麻醉液的注射量应根据体重和麻醉反应进行调整）。

b. 每只小鼠通过眼眶后注射 125μl 1 倍 PBS 稀释的 10μg mRNA-LNP 进行免疫。作为阴性对照，用 1 倍 PBS 对小鼠进行免疫（图 4A）。注意：mRNA-LNP 疫苗可通过其他途径给药，如肌肉注射、皮内注射、皮下注射或鼻内注射。不同的给药途径会对免疫反应的动态和特性产生不同的影响。

c. 在第 5 天给予加强剂量，即 10μg mRNA-LNP 或 1 倍 PBS 作为阴性对照。

a. 在 6 孔板中加入 5ml cold RPMI 培养基，并准备用于脾脏和血液采集的带标签微量离心管。

b. 通过吸入致死剂量的二氧化碳，随后进行颈椎脱臼的方式处死一只小鼠。立即开始解剖。

c. 采血。

d. 脾脏采集。

e. 外周血单个核细胞（PBMC）分离。

f. 脾细胞分离。

g. 第 8 天及以后：使用冷冻的外周血单个核细胞（PBMC）和脾细胞进行多聚体染色分析：注意：在此步骤中，将准备好的 PBMC 和脾细胞用与 mRNA-LNP 疫苗编码的抗原相对应的 MHC-肽多聚体进行染色。最后，每种待分析的组织类型都需要制备对照。

h. 使用新鲜的外周血单个核细胞（PBMC）和脾细胞进行四聚体染色分析。

i. 去除上清液，每孔用 50μl 四聚体染色缓冲液（含 2%胎牛血清的 PBS）和 50nM 达沙替尼重悬。在 25℃ 下孵育 30 分钟。

j. 将四聚体储备液在四聚体染色缓冲液中 1:10 稀释，每孔准备 5μl 稀释后的四聚体溶液。

k. 每孔加入 5μl 四聚体溶液（含 0.5μl 四聚体），重悬所有孔以混合。

l. 在冰上避光孵育 30 分钟。

m. 向每个孔中加入 150μl 四聚体染色缓冲液，然后离心（500×g，5 分钟，4℃）。

n. 撒掉上清液，用 200μl 四聚体染色缓冲液重悬，再次离心（500×g，5 分钟，4℃）。

o. 撒掉上清液，用 100μl 表面染色混合液重悬每个孔。

p. 在冰上避光孵育 25 分钟。每孔准备 100μl 表面染色混合液，含1:1000 的死活染料、1:800 的抗 CD8 AF647 以及 1:400 的抗 CD45 PerCP-Cy5.5、抗 CD3 BV421 和抗 CD4 BV711，均在四聚体染色缓冲液中。

q. 向每个孔中加入 100μl 四聚体染色缓冲液，离心（500×g，5 分钟，4℃）。

r. 撒去上清液。

s. 用 200μl 四聚体染色缓冲液重悬每个孔，再次离心（500×g，5 分钟，4℃）。

t. 撒去上清液，用 200μl 四聚体染色缓冲液重悬。

u. 将样本置于 4℃ 避光保存，直至准备通过流式细胞术进行分析（图 4A - 4E）。注意：最佳荧光素的选择取决于所使用的流式细胞仪。

图 4. mRNA-LNP 疫苗接种后抗原特异性 T 细胞的诱导及抗肿瘤免疫反应

本研究详细介绍了mRNA脂质纳米颗粒疫苗的开发流程和小鼠免疫效率分析的实验方案。从mRNA序列设计到LNP封装，再到小鼠免疫实验，每一步都经过精心设计和严格的质量控制。通过这一方案，我们能够开发出具有高效免疫原性和良好安全性的mRNA疫苗，为预防和治疗疾病提供新的策略。尽管实验过程中存在一些局限性，如仅测量IFN-I反应来评估mRNA免疫原性，以及依赖特定抗体来测量抗原呈递，但通过不断优化和改进，mRNA疫苗技术有望在未来的医学领域发挥更大的作用。