迈安纳

	“基因治疗领域的发展极大地依赖于高效、安全的核酸递送系统。脂质纳米颗粒（LNP）作为一种有前景的递送载体，在mRNA疫苗和疗法中展现了巨大潜力。然而，针对特定器官（如肺部）的有效递送仍面临挑战。本研究旨在利用高通量筛选技术，鉴定具有肺部靶向性的阳离子、可降解类脂质材料。本文介绍了一种基于Barcode的高通量筛选系统，用于鉴定具有肺部靶向效率的阳离子、可降解类脂质材料。通过组合合成180种阳离子、可降解脂质，并进行体内外高通量筛选，我们确定了多种在肺部有效递送mRNA的脂质纳米颗粒（LNP）。其中，LNP-CAD9在肺内皮细胞中成功实现了基因编辑，显示出抗血管生成癌症治疗的潜力。”

	图一、高通量LNP筛选技术促进肺靶向新型阳离子脂质的开发流程示意图

		01 材料与方法

	1.1 脂质合成与初步筛选：
	研究团队组合合成了180种阳离子、可降解的脂质（CAD脂质），这些脂质具有不同的化学结构。使用体外高通量筛选方法，初步评估这些CAD LNP递送mRNA的潜力。

	1.2 Barcode技术应用：
	从初步筛选中选出96种有潜力的CAD LNP，用于封装Barcode DNA和萤火虫荧光素酶（FLuc）mRNA。将这些LNP配方合并，通过系统性给药方式注入小鼠体内。利用深度测序技术，量化不同器官（心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）中Barcode DNA的递送和积累情况。

	1.3 脂质合成与初步筛选：
	根据深度测序结果，选出前4种在肺部具有最高递送效率的LNP进行进一步评估。通过在小鼠体内递送FLuc mRNA，评估这些LNP在肺部的mRNA递送效率。

	1.4 抗血管生成治疗潜力评估：
	选定最佳LNP配方（LNP-CAD9），用于递送CRISPR-Cas9系统和靶向VEGFR2的sgRNA至小鼠肺部。评估LNP-CAD9在肺肿瘤模型中诱导VEGFR2基因敲除和抑制肿瘤生长的能力。

		02 实验结果
	2.1 高通量筛选：
	为了高效地筛选出具有肺部靶向能力的阳离子可降解脂质类似物，研究者们设计了一个基于Barcode DNA的高通量LNP筛选系统。这一系统使得在同一个动物体内能够同时评估多种纳米颗粒，从而极大地提高了筛选效率。研究者们首先合成了180种阳离子可降解脂质（CAD脂质），并通过体外高通量筛选初步评估了它们的递送潜力。在这一阶段，他们利用萤火虫荧光素酶（FLuc）编码的mRNA来研究CAD LNPs的递送能力。随后，从初步筛选出的CAD LNPs中选择了96种，用于封装Barcode DNA和FLuc mRNA。将这些LNP制剂混合后，通过系统给药的方式注入小鼠体内。利用深度测序技术，研究者们能够量化这些LNPs在各个器官（心脏、肝脏、脾脏、肺部和肾脏）中的积累情况，从而识别出具有肺部靶向能力的CAD脂质候选物。通过体内筛选，发现了21种在体内具有肺部递送能力的CAD LNP，并进一步通过富集分析确定了LNP配方（LNP-CAD3、LNP-CAD4、LNP-CAD9和LNP-CAD10），这些配方能够高效地将核酸货物递送到肺部。为了验证Barcode DNA积累量能否准确反映CAD LNPs的mRNA递送能力，研究者们选择了在肝脏中表现最佳的LNP-CAD20进行体内FLuc mRNA递送实验。结果表明，该LNP能够在肝脏中特异性地表达荧光素酶，这支持了高通量Barcode筛选结果的准确性。

	2.2 构效关系研究结果：
	化学结构与递送效率的关系：研究了CAD脂质的化学结构对其递送效率的影响。通过改变脂质的化学特性（如离子化性质、尾部结构等），发现这些变化对LNP的递送效率有显著影响。特定的化学结构特征（如特定的离子化脂质尾部结构）被发现能够增强LNP对肺部的靶向性。 LNP的物理特性与递送效率的关系：研究了LNP的物理特性（如粒径、表面电荷等）对其递送效率的影响。通过调整这些物理特性，发现能够进一步优化LNP的递送效率。例如，具有均匀固体核心形态的CAD LNP在递送mRNA时表现出更高的效率。

	图二、不同结构CAD脂质与体外细胞表达的构效关系研究

	图三、Barcode标记的96种不同阳离子LNP与体内器官靶向分布的构效关系研究

	2.3 最佳LNP配方的确定：
	体内递送效率：为了验证这4种LNP配方的mRNA肺部递送效率，研究人员将含有萤火虫荧光素酶（FLuc）mRNA的LNP-CAD3、LNP-CAD4、LNP-CAD9和LNP-CAD10以0.1mg/kg的剂量系统注射到C57BL/6J雌性小鼠体内。通过生物发光成像技术确认，这4种CAD LNPs均能够按预期将mRNA递送到肺部。与金标准系统的比较：为了评估LNP-CAD9的递送潜能，研究人员还制备了一种金标准肺靶向MC3/DOTAP LNP系统，该系统已被FDA批准用于MC3LNP中的mRNA肺部递送。比较结果显示，LNP-CAD9在肺部递送效率方面显著优于MC3/DOTAP系统

	图四、小鼠肺靶向LNP的优选分子的评价与验证

	2.4 抗血管生成治疗潜力：
	除了评估CAD LNPs的递送效率外，研究者们还探索了它们在抗血管生成癌症治疗中的潜在应用。LNP-CAD9递送Cas9 mRNA和靶向VEGFR2的sgRNA，在4.0 mg/kg的剂量下有效诱导小鼠肺内皮细胞的VEGFR2基因敲除。在肺肿瘤模型中，LNP-CAD9表现出显著的抗血管生成治疗潜力，能够抑制肿瘤生长，其疗效优于金标准的肺趋向性MC3/DOTAP LNP系统。

	图五：CAD9 LNP敲除VEGFR2产生抗血管生产作用治疗小鼠肺肿瘤的效果评价

	03 讨论

	本研究通过高通量筛选技术，成功鉴定了具有肺部靶向性的阳离子、可降解类脂质材料。LNP-CAD9作为其中的佼佼者，在抗血管生成癌症治疗中展现出了巨大潜力。高通量筛选技术的运用，不仅加速了LNP的发现过程，还克服了基因治疗应用中肺部递送的障碍。高通量筛选技术在本研究中的作用主要体现在以下几个方面： 1.提高了筛选效率：通过自动化设备和先进的检测方法，高通量筛选技术能够在短时间内对大量化合物进行快速筛选，从而极大地提高了新药发现的效率。在本研究中，我们成功筛选了180种化学性质不同的CAD LNP，并确定了多种高效递送LNP。 2.增强了筛选准确性：高通量筛选技术具有高度的灵敏度和特异性，能够准确识别出具有潜在生物活性的化合物。在本研究中，我们利用Barcode技术，实现了对LNP体内递送效率的精确量化，从而确保了筛选结果的准确性。 3.拓展了应用范围：高通量筛选技术不仅适用于药物研发领域，还可应用于生物学研究、器官筛查、基因工程等多个方面。在本研究中，我们成功将高通量筛选技术应用于LNP的筛选和优化，为基因治疗领域的发展提供了新的思路和方法。

	参考文献：Xue, Lulu, et al. "High-throughput barcoding of nanoparticles identifies cationic, degradable lipid-like materials for mRNA delivery to the lungs in female preclinical models." Nature Communications 15.1 (2024): 1884.

01材料与方法

02实验结果

为了高效地筛选出具有肺部靶向能力的阳离子可降解脂质类似物，研究者们设计了一个基于Barcode DNA的高通量LNP筛选系统。这一系统使得在同一个动物体内能够同时评估多种纳米颗粒，从而极大地提高了筛选效率。

研究者们首先合成了180种阳离子可降解脂质（CAD脂质），并通过体外高通量筛选初步评估了它们的递送潜力。在这一阶段，他们利用萤火虫荧光素酶（FLuc）编码的mRNA来研究CAD LNPs的递送能力。

03讨论

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材料与方法

02
实验结果

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讨论