01
背景与挑战

神经系统疾病是全球致残的首要原因，也是第二大死亡原因。其中，中风和痴呆（包括阿尔茨海默病）是主要的致死原因之一。近年来，核酸疗法（如mRNA蛋白替代疗法或基因编辑疗法）开始被探索用于治疗神经系统疾病。例如，有研究使用血红素加氧酶1（HO1）自复制mRNA治疗缺血性中风，以及使用脑源性神经营养因子（BDNF）mRNA治疗阿尔茨海默病。

血脑屏障（BBB）是大脑的天然保护屏障，由脑毛细血管内皮细胞、基底膜、星形胶质细胞和周细胞组成。BBB阻止了约98%的小分子药物和几乎100%的大分子药物进入大脑。因此，LNP必须穿越这一高度选择性的屏障才能到达大脑。然而，目前缺乏高效递送载体的原因之一是缺乏信息丰富的体外筛选平台。

图示静脉给药后LNP-RNA的体内分布

02
高通量筛选平台的开发

为了解决上述问题，Mike Mitchell Lab开发了一个用于高通量筛选mRNA LNP的血脑屏障转运模型（HTS-BBB）。该模型建立在96孔Transwell板上，每个孔由生长在半透膜上的脑内皮单层组成，将顶室（代表血液侧）和基底外侧室（代表脑侧）分开。这种设计允许同时评估LNP的转染效率和跨单层的转运效率。

图1：血脑屏障（BBB）的生理学示意图，以及高通量筛选血脑屏障平台（HTS-BBB）的开发，该平台用于识别能够穿越并转染血脑屏障、适用于神经系统疾病治疗的mRNA脂质纳米颗粒（mRNA LNPs）。

研究人员选择了永生化人微血管脑内皮细胞（hCMEC/D3）作为细胞系，因为它们在1型胶原蛋白（BBB基底膜的关键成分）上生长时，能够形成具有接触抑制特性的单层细胞，并表达紧密连接和粘附连接，从而有助于调节BBB的结构完整性和渗透性。例如，在96孔Transwell板上，hCMEC/D3细胞以30000 cells/cm²的密度接种，6天后形成完整的单层。研究人员通过活/死成像技术监测细胞生长情况，并使用共聚焦显微镜分析单层的完整性。此外，研究人员还检测了单层对FITC-葡聚糖的转运能力，结果显示10 kDa和70 kDa的FITC-葡聚糖的转运率分别为5%和2%，表明单层具有高度的结构完整性和选择性通透性。

图 2. 高通量血脑屏障模型中脑内皮单层生长的优化。

为了同时评估LNP的转染和转运效率，研究人员制备了含有荧光素酶（Luciferase）mRNA的LNP，并添加了1%的亲脂性染料DiR。荧光素酶mRNA用于评估LNP的转染效率，而DiR用于追踪LNP的转运。实验结果显示，Luciferase的发光信号比mCherry荧光信号更为灵敏。研究人员还发现，DiR的摩尔比对LNP的转染能力有显著影响，1%的DiR摩尔比是最佳选择。此外，研究人员还评估了不同处理时间对转染效率的影响，发现24小时的信号强度显著高于6小时，表明更长的处理时间有助于mRNA的翻译。

图 3. 在 HTS-BBB 中优化 mRNA LNP 转染和运输报告基因。

03
实验结果与验证

研究人员设计了一个包含14种具有独特可电离脂质结构的LNP库，并在HTS-BBB平台上进行筛选。这些LNP的物理化学特性（如粒径、zeta电位和mRNA包封效率）均进行了详细表征。研究人员还评估了LNP的细胞毒性和转染效率，发现不同LNP在转染效率和细胞毒性方面存在显著差异。例如，LNP3和LNP8表现出较高的转运效率但较低的转染效率，而LNP1、LNP4和LNP10则表现出较高的转染效率。

图 4.在 HTS-BBB 中筛选用于转染和运输的 LNP 库。

为了验证HTS-BBB平台的预测性，研究人员将筛选出的LNP包封Luc-mRNA，按照0.3 mg/kg mRNA剂量静脉注射到小鼠体内。检测结果显示，LNP4和LNP10在大脑中的荧光信号最强，其中LNP4的荧光信号强度超过LNP3的1000倍。此外，注射LNP4的小鼠大脑荧光强度占总荧光强度的1%，而注射LNP3的小鼠大脑荧光强度仅占0.2%。

图 5. HTS-BBB mRNA LNP文库筛选的体内验证。

04
研究意义与展望

HTS-BBB平台为开发高效递送至大脑的LNP提供了一个有力的工具，有望推动核酸疗法在神经系统疾病治疗中的应用。具有高脑内皮转染率的LNP可用于递送mRNA来修复BBB，例如在中风和创伤性脑损伤等炎症性脑病理中；具有高BBB透过性的LNP可以进一步优化，以转染特定的脑细胞类型，如神经元或星形胶质细胞。

尽管HTS-BBB平台已经取得了一定的成果，但它仍然相对简单，目前只包含内皮细胞和初步的神经元共培养。未来的工作可以包括增加平台的复杂性，例如添加其他细胞类型（如星形胶质细胞、周细胞或小胶质细胞），或者研究神经免疫通讯。此外，该平台还可以扩展到其他生物屏障的研究，如血-胎盘屏障或血-视网膜屏障。

05
总结

HTS-BBB平台为核酸疗法的开发提供了一个高效、可靠的体外筛选工具，有望加速针对神经系统疾病的治疗策略的开发。通过优化脑内皮单层生长条件和转染及转运报告系统，研究人员成功筛选出具有高效转染和转运能力的LNP，并在体内实验中验证了其预测性。未来，该平台有望进一步扩展其应用范围，为开发针对其他疾病的高效递送系统提供支持。