图一、DNA/LNP的设计和实验验证模型

01
实验材料

• 可电离脂质：DLin-MC3-DMA（MC3）、SM-102、ALC-0315。
• 辅助脂质：胆固醇、DOPC（二油酰磷脂酰胆碱）、DMPE-PEG2k（1,2-二甲基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000）。
• DNA质粒：编码荧光标记物或荧光素酶的DNA表达质粒（3-4kbp）。
• 细胞系：快速增殖的人肝癌HuH-7细胞和缓慢复制的mPH细胞。
• 实验动物：野生型小鼠。

02
结果

本研究中，针对RNA递送设计的LNP脂质组成被评估其用于结合DNA表达质粒的潜力。所生成的DNA-LNP的脂质组成包括：1) 可电离脂质，2) 胆固醇，3) 辅助脂质，和4) PEG偶联脂质，摩尔比为50:39:10:1（图1A）。比较了三种临床上使用的可电离脂质，即DLin-MC3-DMA（MC3）、SM-102和ALC-0315。

通过微流控混合技术封装纳米质粒DNA后，对DNA-LNP进行了表征。所有DNA-LNP制剂均在N/P比为6（即可电离脂质与DNA的电荷比）的条件下生成。表征结果显示，所有制剂均呈现出适宜的粒径和ζ电位，确保了它们的稳定性和细胞内摄取潜力。

图二、DNA/LNP的表征

为了评估LNP封装的DNA的细胞摄取，使用Cy3标记了编码EGFP的纳米质粒DNA，并将其与HuH-7和mPH细胞孵育。DNA-LNP以10至50ng DNA/cm²的最终浓度添加，并孵育至72小时。通过流式细胞术和共聚焦显微镜分析细胞摄取和转基因表达。

在HuH-7细胞中，MC3 LNPs显示出最高的EGFP表达水平，约60%的细胞表达了EGFP，而ALC-0315 LNPs的表达水平略低（40%）。在mPH细胞中，由于强自发荧光，选择了tdTomato作为报告基因进行成像。SM-102 LNPs在此细胞系中表现出优越性，有7%的细胞表达了tdTomato，而ALC-0315 LNPs的表达水平显著降低。

通过实时聚合酶链反应（qPCR）量化了DNA拷贝数的递送。DNA-LNP孵育24小时后，使用QIAprep Spin Mini-prep Kit提取递送的DNA，并制备DNA校准曲线以计算拷贝数。结果显示，在HuH-7细胞中，MC3 LNPs递送的DNA拷贝数最高，而在mPH细胞中，SM-102 LNPs显示出最高的递送效率。

图三、DNA/LNP的体外摄取评价

图四、DNA/LNP的体外转染评价

通过尾静脉注射向野生型小鼠体内递送了封装有20µg DNA的DNA-LNPs，并在24小时后处死小鼠以评估生物分布和转基因表达。器官被收集、匀浆，并通过qPCR确定递送的DNA拷贝数。结果显示，肝脏和肺脏中积累了最高比例的荧光素酶DNA，分别为11.3±2.8%和7.5±1.9%的注射剂量（ID），而脾脏中的积累水平较低（2.6±0.7% ID）。这一趋势在所有DNA-LNP制剂中均一致观察到。

体内转基因表达通过生物发光成像进行评估。在注射DNA-LNPs 24小时后，向小鼠腹腔注射d-荧光素，并使用生物成像系统监测生物发光。结果显示，MC3和SM-102 LNPs在肝脏中诱导了显著的荧光素酶表达，而ALC-0315 LNPs的表达水平较低。这些结果与体外实验结果一致，进一步证实了MC3和SM-102 LNPs在DNA递送和转基因表达方面的优越性。

图五、DNA/LNP在小鼠中的体内分布和表达

03
讨论

本研究表明，临床用LNP制剂在设计用于DNA基因递送时，需进行先期评估。可电离脂质的选择对LNP的理化性质、细胞转染效率和基因表达水平具有重要影响。含有ALC-0315的LNP在体内实验中表现出更高的转基因表达水平，这可能与其有利的理化性质、良好的细胞摄取和基因递送能力有关。然而，SM-102在某些细胞系中表现出更高的DNA递送量和荧光强度，提示在不同细胞环境中可能需要选择不同的可电离脂质以优化基因递送效果。

此外，LNP的粒径、电荷等理化性质对细胞摄取和基因递送具有重要影响。本研究中，含有ALC-0315的LNP粒径小于100nm，有利于细胞摄取和基因递送。未来研究可进一步探索LNP理化性质与基因递送效率之间的关系，以优化LNP设计。

04
结论

本研究通过比较不同临床用可电离脂质在LNP介导的DNA递送中的性能，发现含有ALC-0315的LNP在体内实验中表现出更高的转基因表达水平。这一发现为LNP在DNA基因治疗中的应用提供了有价值的见解，为未来优化LNP基因载体提供了实验依据。未来研究可进一步探索LNP理化性质、细胞摄取、基因递送效率之间的复杂关系，以推动LNP在基因治疗领域的广泛应用。