图一、流程示意图

01
材料与方法

1. LNP制剂的制备：本研究使用了一系列不同的PEG-脂质，包括不同尾部长度（C8、C14、C16、C18）和化学连接键的PEG-脂质，与可离子化脂质ALC-0315、辅助脂质DSPC和胆固醇结合，通过手动和微流体混合技术制备LNPs。

2. 体外转染效率评估：使用HepG2和A549细胞系评估不同PEG-脂质含量、尾部长度和化学连接键对mRNA转染效率的影响。

3. 体内免疫原性评估：在小鼠模型中评估了不同PEG-脂质组成的LNPs的免疫原性，通过检测抗体产生和细胞免疫反应来评估疫苗的有效性。

图二、化学结构示意图

02
结果

封装效率：研究结果显示，当PEG-脂质的摩尔含量超过3.0%时，通过手工混合制备的mRNA-LNPs中mRNA的封装效率显著降低。这可能是由于PEG-脂质含量的增加导致LNP结构稳定性下降，进而影响了mRNA的封装。

mRNA翻译效率：此外，PEG-脂质含量的增加还显著降低了mRNA的翻译效率。这可能与PEG-脂质在LNP表面的密集排列有关，该排列可能阻碍了mRNA从LNP中的有效释放和随后的细胞摄取。

图三、不同PEG含量对mRNA/LNP包封率的影响

图四、不同PEG含量对mRNA/LNP在HepG2细胞转染的影响

体外转染效率：在评估脂质尾部长度对mRNA-LNPs体外转染效率的影响时，发现具有较短脂质尾部长度的PEG-脂质在HepG2细胞中产生了显著更高的发光强度。具体而言，与C16-Ceramide-PEG相比，C8-Ceramide-PEG在1.6%摩尔含量下表现出6.21倍的发光强度增加。这一结果表明，较短尾部长度的PEG-脂质更有利于mRNA的体外递送和表达。

图五、不同PEG长度对mRNA/LNP在HepG2细胞转染的影响

体内蛋白表达：在体内实验中，也观察到了脂质尾部长度对mRNA-LNPs蛋白表达水平的影响。使用C8-Ceramide-PEG制备的LNPs在皮下注射后产生了与ALC-0159和C16-Ceramide-PEG LNPs相当的蛋白表达水平，进一步证实了较短尾部长度PEG-脂质在体内递送mRNA方面的有效性。

图六、不同PEG长度对mRNA/LNP体内表达的影响

与脂质尾部长度和PEG-脂质含量相比，PEG与脂质之间的化学连接对mRNA-LNPs的理化性质和翻译效率影响较小。在本研究中，不同化学连接的PEG-脂质（如酯键、氨基甲酸酯键等）在制备的LNPs中未观察到显著差异。然而，值得注意的是，这种影响可能因PEG-脂质的种类和实验条件而异，因此在未来的研究中仍需进一步探讨。

稳定性：研究发现，C8-Ceramide-PEG具有较短的脂质尾部，可能影响mRNA-LNPs的血清稳定性。然而，在48小时的孵育期间，所有测试的LNP制剂均保持了相对稳定的粒径和封装效率。

免疫原性：PEG-脂质的脂质尾部长度还显著影响了抗PEG抗体的诱导。具体而言，使用较短尾部长度的PEG-脂质制备的LNPs在诱导抗PEG IgM和IgG抗体方面表现出较低的水平。这一发现对于降低mRNA疫苗的免疫原性和提高安全性具有重要意义。

图七、不同PEG种类对mRNA/LNP免疫原性的影响

03
讨论

本研究结果揭示了PEG-脂质在mRNA-LNPs递送系统中的关键作用。PEG-脂质的含量、脂质尾部长度和化学连接键均会影响LNPs的性质和递送效率。为了优化mRNA疫苗的递送系统，需要仔细选择PEG-脂质的组成和制备条件。此外，本研究还发现PEG-脂质的免疫原性是一个需要关注的问题，特别是在长期或重复给药的情况下。未来的研究应进一步探讨如何降低PEG-脂质的免疫原性，以提高mRNA疫苗的安全性和有效性。