眼部前段疾病是全球导致视力损害和失明的主要原因之一，其中白内障、青光眼和视网膜疾病尤为突出。这些疾病严重影响患者的生活质量，且治疗手段有限。近年来，基因治疗作为一种新兴的治疗方法，在眼部疾病治疗中展现出巨大潜力。脂质纳米颗粒作为非病毒载体，具有高效、安全、生物相容性好等优点，在眼部基因治疗中受到广泛关注。本研究旨在探索LNP介导的mRNA递送在眼部前房基因表达和编辑中的应用，为眼部前段疾病的治疗提供新的思路。

脂质纳米颗粒（LNPs）在视网膜疾病的基因治疗领域显示出巨大潜力。本研究旨在扩展LNP的应用，探索通过前房内注射（IC）途径将LNP介导的mRNA递送至眼部前房，以实现基因表达和编辑。研究结果显示，IC注射LNP可促进蛋白表达和基因编辑，且未观察到眼部毒性，表明IC注射LNP的安全性。本研究为LNP在眼部前房疾病治疗中的应用提供了有力证据。

图一、示意图

01
材料与方法

1.LNP制备：采用离子化脂质、辅助脂质、胆固醇和聚乙二醇化脂质制备LNP，封装mRNA。

2.动物模型：选用Ai9小鼠和C57BL/6小鼠作为实验动物。

3.前房内注射：通过显微注射技术将LNP注射至小鼠眼部前房。

4.基因表达和编辑检测：采用荧光显微镜、免疫组化和高通量测序等技术检测基因表达和编辑效率。

02
结果

本研究中，我们使用微流控混合法制备了封装有Cre-重组酶mRNA、mCherry mRNA或Cas9 mRNA-sgRNA的LNP。LNP的制备包括将mRNA溶于柠檬酸盐缓冲液（pH 4.0）作为水相，而将LP01/DSPC/胆固醇/DMG-PEG2k溶于乙醇作为有机相，摩尔比为50/10/38.5/1.5。制备的LNP用磷酸盐缓冲盐水（PBS）稀释后用于注射。LNP的表征显示其粒径均匀，封装效率高，且稳定性良好，为后续的体内实验提供了基础。

图二、LNP的表征

为了评估LNP在前房的转染效果，我们首先使用封装有Cre-mRNA的LNP对Ai9小鼠进行IC注射。Ai9小鼠是一种报告基因小鼠，其基因组中整合了loxP位点两侧的tdTomato基因，当Cre酶存在时，loxP位点间的序列会被切除，从而激活tdTomato基因的表达。结果显示，IC注射后1周，通过共聚焦显微镜观察到角膜内皮和虹膜角膜角处出现强烈的tdTomato荧光信号，表明Cre-mRNA成功递送并被翻译成Cre酶，进而实现了基因重组。

随后，我们使用封装有mCherry-mRNA的LNP对C57BL/6小鼠进行IC注射，以评估LNP在前房组织的蛋白表达情况。mCherry是一种红色荧光蛋白，其表达依赖于mCherry mRNA的摄取和翻译。结果显示，注射后72小时，虹膜角膜角处的小梁网（TM）组织出现强烈的mCherry荧光信号，且该信号在注射后120小时内逐渐减弱。这一结果表明，LNP能够选择性地将mRNA递送至TM组织，并实现局部蛋白表达。

图三、TdTomato在虹膜角膜角的表达（由Cre LNP转染后）

图四、LNP介导的mCherry在虹膜角膜角的表达

最后，我们制备了封装有Cas9 mRNA和sgAi9 guide RNA的LNP，以探索在前房组织中的基因编辑效果。sgAi9是一种针对Ai9小鼠中floxed-stop密码子的sgRNA，能够引导Cas9酶切割该位点，从而激活tdTomato基因的表达。结果显示，IC注射后，通过共聚焦显微镜观察到虹膜角膜角处出现强烈的tdTomato荧光信号，且该信号随着注射剂量的增加而增强。这表明Cas9-sgAi9 LNP成功递送并被翻译成Cas9酶和sgRNA，进而实现了基因编辑。

图五、Cas9-sgAi9 LNP注射后虹膜角膜角的基因编辑

03
讨论

本研究成功证明了LNP介导的mRNA递送在眼部前房基因表达和编辑中的应用潜力。LNP作为非病毒载体，具有高效、安全、生物相容性好等优点，在眼部基因治疗中展现出巨大优势。通过前房内注射途径，LNP能够直接将mRNA递送至目标组织，实现局部高浓度的药物暴露，从而提高治疗效果。此外，LNP还具有良好的生物屏障穿透能力，能够克服眼部组织对药物的吸收障碍。然而，本研究仍存在一些局限性。例如，LNP在体内的分布和代谢机制尚不完全清楚，需要进一步深入研究。此外，虽然本研究未观察到眼部毒性，但长期安全性仍需进一步评估。