图一、示意图

眼部前段疾病是全球导致视力损害和失明的主要原因之一，其中白内障、青光眼和视网膜疾病尤为突出。这些疾病严重影响患者的生活质量，且治疗手段有限。近年来，基因治疗作为一种新兴的治疗方法，在眼部疾病治疗中展现出巨大潜力。脂质纳米颗粒作为非病毒载体，具有高效、安全、生物相容性好等优点，在眼部基因治疗中受到广泛关注。本研究旨在探索LNP介导的mRNA递送在眼部前房基因表达和编辑中的应用，为眼部前段疾病的治疗提供新的思路。

脂质纳米颗粒（LNPs）在视网膜疾病的基因治疗领域显示出巨大潜力。本研究旨在扩展LNP的应用，探索通过前房内注射（IC）途径将LNP介导的mRNA递送至眼部前房，以实现基因表达和编辑。研究结果显示，IC注射LNP可促进蛋白表达和基因编辑，且未观察到眼部毒性，表明IC注射LNP的安全性。本研究为LNP在眼部前房疾病治疗中的应用提供了有力证据。

我们首先考察了mRNA水溶液的pH值（3、4、5、6）、盐种类（柠檬酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐+氯化钠、醋酸盐+氯化钠）和盐浓度（10、25、50、100 mM）对LNPs的粒径、多分散指数（PDI）、zeta电位和包封效率（EE）的影响。结果表明，mRNA水溶液的pH值对LNPs的粒径、zeta电位和EE具有显著影响，尤其是pH值为4时，EE最高（91.8%），粒径最大（120.3 nm）。相关性分析显示，pH值与粒径、EE呈负相关，而盐浓度与粒径呈正相关，但影响较小。此外，盐种类对LNPs的理化性质无显著影响。在细胞转染实验中，pH值为4的mRNA水溶液制备的LNPs在DC2.4、AML12和C2C12细胞中表现出最高的转染效率，表明mRNA水溶液的pH值是影响LNPs转染效率的关键因素。

图二、mRNA 水溶液对mRNA/LNP的影响。

我们进一步探讨了LNP稀释溶液的pH值（4、5、6）、盐种类（磷酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐）和盐浓度（10、25、50 mM）对LNPs的影响。结果显示，稀释溶液的pH值和盐种类对LNPs的粒径、PDI、zeta电位和EE无显著影响，仅盐浓度与zeta电位呈负相关。在细胞转染实验中，稀释溶液的pH值、盐种类和浓度对LNPs的转染效率也无显著影响，仅在C2C12细胞中观察到pH值为4时转染效率略有提高。因此，稀释溶液对LNPs的理化性质和转染效率的影响较小。

图三、稀释溶液对mRNA/LNP的影响。

我们还考察了超滤溶液的pH值（4、5、6）、盐种类（磷酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐）和盐浓度（10、25、50 mM）对LNPs的影响。结果显示，超滤溶液的pH值对LNPs的粒径、EE和PDI有显著影响，尤其是pH值为4时，EE最低（79%），粒径最小（80 nm）。相关性分析表明，pH值与粒径呈负相关，与EE呈正相关。在细胞转染实验中，pH值为4或5的超滤溶液制备的LNPs在DC2.4、AML12和C2C12细胞中表现出较高的转染效率。此外，盐种类和浓度对LNPs的理化性质和转染效率无显著影响。而当超滤溶液最终置换成保存液后，相关现象消失，显示最终的保存液影响了颗粒的性质。而超滤溶液的pH值对LNPs性能的影响值得进一步的研究。

图四、超滤溶液对mRNA/LNP的影响。

最后，研究评估了保存溶液的盐种类（Tris、HEPES、PBS）、盐浓度（10、20、30 mM）和蔗糖含量（0、150、300 mM）对LNPs的影响。结果显示，保存溶液对LNPs的粒径、PDI、zeta电位和EE无显著影响。然而，在细胞转染实验中，蔗糖含量对LNPs的转染效率有显著影响，尤其是在DC2.4细胞中，300 mM蔗糖组的转染效率最高。此外，盐种类对AML12细胞的转染效率有显著影响，而盐浓度无显著影响。我们对不同制备溶液形成的LNPs进行了冻融稳定性测试。结果显示，保存溶液中的蔗糖浓度对LNPs的冻融稳定性有显著影响。具体而言，300 mM蔗糖组的LNPs在冻融后表现出最佳的稳定性，其粒径和EE变化最小。相比之下，缺乏蔗糖保护的LNPs在冻融后粒径显著增加，EE明显下降。

图五、保存溶液对mRNA/LNP的影响。

在综合考虑上述结果的基础上，研究进一步探讨了不同制备溶液组合对LNPs性能的影响，并选用了文献常用的LNP制备方式作为对照组（即mRNA水相溶液=pH 4的柠檬酸缓冲液，稀释、超滤和保存液都选用1X PBS）。结果显示，不同制备溶液组合对LNPs的粒径、PDI、zeta电位和EE有显著影响。在体外转染实验中，少数组合表现出与对照组相当的转染效率，但是实验组的包封率和冷冻稳定性均显著好于对照组。在体内实验中，不同组合的LNPs表现出显著不同的表达效率和体内分布特点。特别是，超滤溶液的pH值对体内表达效率有显著影响。随着pH值的升高，无论肌肉给药还是静脉给药，LNP的肝脏特异性表达都越高。此外，冻融稳定性实验表明，虽然LNP最后都保存在含有蔗糖的溶液中，但是不同制备溶液组合的LNPs在冻融过程中的稳定性存在显著差异，E15组合表现出较好的稳定性。这些结果表明，最终的保存条件不是影响LNP冷冻稳定性的唯一因素，制备过程也会显著影响LNP的稳定性，优化制备溶液的成分对于提高LNPs的冻融稳定性至关重要。

为了进一步研究造成相同SM-102处方在不同制备条件下显示出不同的理化性质和体内外表达的原因，我们选取了E1，E7，E9，E15和对照组进行冷冻电镜成像，结果显示不同条件制备的LNP的颗粒结构差别很大，其中E1存在13.4%小于30 nm的空囊泡，7.8%占体积大于1/3和5.6%少于1/3的bleb结构；E7则存在56.4%占体积少于1/3的bleb结构和2.3%大于1/3的bleb结构；E9和E15分别存在0.9%，1.3%占体积少于1/3的bleb结构；对照组则存在5.7%占体积大于1/3和4.4%少于1/3的bleb结构。电镜结果可以部分解释相同LNP成分，但是呈现不同理化性质和表达效果的原因。

图六、不同组合制备溶液对mRNA/LNP的影响。

图七、制备溶液中与脂质纳米颗粒的理化性质及转染之间的相关的因素

图八、用不同溶液制备的脂质纳米颗粒在冻融后的稳定性。

本研究表明，制备溶液的pH值、盐种类和浓度对mRNA/LNPs的理化性质、稳定性和表达效率有显著影响。特别是，mRNA水溶液的pH值和超滤溶液的pH值是影响LNPs性能的关键因素。此外，保存溶液中的蔗糖含量对LNPs的冻融稳定性至关重要。这些发现为优化mRNA/LNPs制剂的设计和开发提供了重要的理论依据，特别是利用mRNA进行细胞疗法和局部或静脉给药进行药物开发的客户，有助于提高其在临床应用中的疗效和稳定性。