mRNA疫苗通过将编码病原体抗原的mRNA递送至人体细胞，利用人体自身的翻译机制产生抗原蛋白，从而激活免疫系统。尽管mRNA疫苗在诱导强效体液和细胞免疫应答方面表现出色，但其具体的免疫机制，特别是在注射部位的早期反应，仍需深入研究。本研究聚焦于mRNA疫苗在注射部位诱导的先天性免疫反应，特别是IFN-β的作用。本研究旨在通过单细胞转录组学分析，探讨mRNA疫苗在注射部位的早期免疫反应，特别是脂质纳米颗粒（LNP）和mRNA成分如何协同作用，诱导I型干扰素（IFN）反应，并促进细胞免疫。

01
材料与方法

实验设计：本研究使用雌性BALB/c小鼠作为实验模型，通过肌肉注射给予LNP、LNP-mRNA或生理盐水作为对照。在注射后不同时间点（2小时、16小时和40小时）收集注射部位肌肉组织，进行单细胞RNA测序分析。

单细胞RNA测序：使用10x Genomics平台进行单细胞RNA测序，构建注射部位肌肉组织的单细胞转录组图谱。通过差异基因表达分析、主成分分析（PCA）和细胞间相互作用网络分析等方法，系统解析mRNA疫苗在注射部位诱导的免疫反应。

功能验证：通过ELISA、IFN-γ ELISpot和流式细胞术等方法，验证IFN-β在mRNA疫苗诱导的细胞免疫应答中的作用。

02
实验结果

通过主成分分析（PCA），我们对mRNA疫苗在注射部位诱导的免疫反应进行了系统性解析。结果显示，这些免疫反应主要分为两个轴：

• PC1轴：代表由脂质纳米颗粒（LNP）成分驱动的基质细胞炎症反应。这一轴的反应在空LNP（不含mRNA成分的LNP）和LNP-mRNA注射后均显著增强，表明LNP本身具有强大的佐剂效应，能够诱导基质细胞（如成纤维细胞、内皮细胞和壁细胞）产生炎症反应。
• PC2轴：代表由mRNA成分驱动的树突状细胞（DCs）I型干扰素（IFN）反应。这一轴的反应特异性地出现在LNP-mRNA注射后，而在空LNP注射后未观察到显著变化。这表明mRNA成分在注射部位能够特异性地诱导DCs产生I型IFN反应。

Fig. 1 | Single-cell atlas ofmRNA vaccine injection-site responses.

Fig. 2 | Major axes of the transcriptional responses elicited by mRNA vaccine injection.

通过单细胞RNA测序分析，我们详细剖析了mRNA疫苗在注射部位各细胞类型中的分布情况。结果显示，mRNA疫苗中的mRNA在注射部位成纤维细胞中高度富集。特别是在注射后16小时，成纤维细胞中的mRNA含量显著高于其他细胞类型。

进一步的分析还表明，成纤维细胞在注射mRNA疫苗后表达IFN-β基因（Ifnb1），且这种表达特异性地由mRNA成分诱导。空LNP注射后的成纤维细胞中未检测到Ifnb1的表达，进一步证实了mRNA成分在诱导IFN-β表达中的特异性作用。

Fig. 3 | Enrichment of mRNA vaccine transcripts in injection-site fibroblasts.

为了验证IFN-β在mRNA疫苗诱导的细胞免疫应答中的作用，我们进行了一系列功能验证实验。首先，我们通过ELISA检测了注射部位肌肉组织和血清中的IFN-β水平，发现LNP-mRNA注射后IFN-β水平显著升高，而空LNP注射后则未观察到显著变化。

接下来，我们通过IFN-γ ELISpot实验评估了不同免疫策略下小鼠的抗原特异性细胞免疫应答。结果显示，在LNP+亚单位疫苗免疫策略中，共注射IFN-β显著增强了抗原特异性细胞免疫应答。相反，在LNP+mRNA疫苗免疫策略中，由于内源性IFN-β的产生已经达到饱和水平，共注射IFN-β并未进一步增强细胞免疫应答。

为了进一步验证IFN-β在细胞免疫应答中的作用，我们还使用了IFN-β中和抗体进行阻断实验。结果显示，在LNP+mRNA疫苗免疫策略中，注射部位IFN-β信号的阻断显著降低了抗原特异性CD8+ T细胞应答。这些结果共同表明，注射部位的IFN-β在mRNA疫苗诱导的细胞免疫应答中发挥了关键作用。

Fig. 4 | mRNA-specific induction of IFN-β in injection-site fibroblasts.

除了上述发现外，我们还对注射部位成纤维细胞的动态变化进行了深入分析。通过轨迹分析，我们发现空LNP注射后，成纤维细胞群体发生了显著变化，出现了Fib_Cxcl5和Fib_Ccl19两种炎症性成纤维细胞亚群。这些亚群高表达多种趋化因子基因，能够招募免疫细胞到注射部位。

进一步的分析还表明，Fib_Cxcl5和Fib_Ccl19亚群的出现依赖于LNP成分，而mRNA成分则主要诱导成纤维细胞表达IFN-β基因。这些发现进一步强调了LNP和mRNA作为mRNA疫苗两大组分在诱导注射部位免疫反应中的不同作用。

在mRNA疫苗注射后，我们不仅观察到了成纤维细胞对mRNA的响应和IFN-β的产生，还注意到树突状细胞（DCs）在免疫反应中的关键作用。特别是在PC2轴上，DCs表现出了强烈的I型IFN反应。通过深入分析，我们发现mRNA-LNP注射后，注射部位和引流淋巴结（dLNs）中的DCs高度表达IFN刺激基因（ISGs），这些DCs被命名为mDC_ISGs。这些mDC_ISGs细胞在注射后约16小时达到高峰，且其比例在LNP-mRNA注射后显著高于空LNP注射后。

为了追踪mDC_ISGs的命运，我们还对dLNs进行了单细胞RNA测序分析。结果显示，mDC_ISGs细胞群也存在于dLNs中，并且同样高表达IFN响应特征。这表明mDC_ISGs细胞不仅在注射部位产生，还能够迁移到dLNs，可能在适应性细胞免疫应答的起源中发挥作用。

为了验证IFN-β在DCs功能中的作用，我们进行了一系列功能验证实验。结果显示，在LNP+亚单位疫苗免疫策略中，共注射IFN-β显著增强了抗原特异性细胞免疫应。这表明IFN-β能够激活DCs，进而促进T细胞的活化和扩增。此外，我们还发现，在LNP+mRNA疫苗免疫策略中，虽然内源性IFN-β的产生已经达到饱和水平，但阻断IFN-β信号仍然显著降低了抗原特异性CD8+ T细胞应答。这些结果共同表明，IFN-β在DCs介导的抗原呈递和T细胞激活过程中发挥了关键作用。

Fig. 5 | mRNA-specific induction of type I IFN responses in mDCs.

Fig. 6 | Injection-site IFN-β guides cellular immune responses against mRNA vaccine.

03
讨论

本研究首次系统解析了mRNA疫苗在注射部位诱导的免疫反应，并揭示了IFN-β在促进细胞免疫应答中的关键作用。我们发现，mRNA疫苗中的mRNA成分特异性地在注射部位成纤维细胞中诱导IFN-β表达，进而激活DCs的I型IFN反应，最终促进抗原特异性细胞免疫应答。

此外，本研究还强调了LNP和mRNA作为mRNA疫苗两大组分的不同免疫佐剂效应。LNP成分主要通过诱导基质细胞炎症反应发挥佐剂作用，而mRNA成分则通过诱导IFN-β表达促进细胞免疫应答。这一发现为优化mRNA疫苗设计提供了新的思路。

04
结论

本研究通过单细胞转录组学分析，深入探讨了mRNA疫苗在注射部位的早期免疫反应，特别是IFN-β在促进细胞免疫应答中的作用。我们的研究不仅增进了对mRNA疫苗免疫机制的理解，还为开发更高效、更安全的mRNA疫苗提供了科学依据。